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GB 4789.14-2014

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标准详细信息 GB 4789.14-2014; GB4789.14-2014
中文名称: 食品安全国家标准 食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验
英文名称: National Standard (All industries)
行业: 国家标准
中标分类: C53
国际标准分类: 07.100.30
字数估计: 19,000
发布日期: 1/12/2014
实施日期: 1/5/2015
旧标准 (被替代): GB/T 4789.14-2003
归口单位: 国家卫生和计划生育委员会
标准依据: 国家卫生计生委公告2014年第19号
发布机构: 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
范围: 本标准规定了食品中蜡样芽胞杆菌的检验方法。本标准第一法适用于蜡样芽胞杆菌含量较高的食品样品中蜡样芽胞杆菌的计数;第二法适用于蜡样芽胞杆菌含量较低的食品样品中蜡样芽胞杆菌的计数。

GB 4789.14-2014
(National food safety standards of food microbiological examination of Bacillus cereus test)
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验
()
2014-12-01发布
2015-05-01实施
前言
本标准代替 GB/T 4789.14-2003《食品卫生微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验》。
本标准与 GB/T 4789.14-2003 相比,主要变化如下:
--修改了标准的中文名称;
--增加了第二法 蜡样芽胞杆菌 MPN 计数法;
--将选择性分离培养基(MYP)培养条件由 37 ℃培养 12 h~20 h 改为 30 ℃±1 ℃培养 24 h~
48 h;
--增加了溶菌酶试验;
--修改了操作步骤;
--增加了附录 A、附录 B。
食品安全国家标准
食品微生物学检验 蜡样芽胞杆菌检验
1 范围
本标准规定了食品中蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus)的检验方法。
本标准第一法适用于蜡样芽胞杆菌含量较高的食品中蜡样芽胞杆菌的计数;第二法适用于蜡样芽胞杆
菌含量较低的食品样品中蜡样芽胞杆菌的计数。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
a) 冰箱:2 ℃~5 ℃;
b) 恒温培养箱:30 ℃±1 ℃、36 ℃±1 ℃;
c) 均质器;
d) 电子天平:感量 0.1 g ;
e) 无菌锥形瓶:100 mL、500 mL;
f) 无菌吸管:1 mL(具 0.01 mL 刻度)、10 mL(具 0.1 mL 刻度)或微量移液器及吸头;
g) 无菌平皿:直径 90 mm;
h) 无菌试管:18 mm×180 mm;
i) 显微镜:10 倍~100 倍(油镜);
j) L 涂布棒。
3 培养基和试剂
3.1 磷酸盐缓冲液(PBS):见附录 A 中 A.1。
3.2 甘露醇卵黄多黏菌素(MYP)琼脂:见附录 A 中 A.2。
3.3 胰酪胨大豆多黏菌素肉汤:见附录 A 中 A.3。
3.4 营养琼脂:见附录 A 中 A.4。
3.5 过氧化氢溶液:见附录 A 中 A.5。
3.6 动力培养基:见附录 A 中 A.6。
3.7 硝酸盐肉汤:见附录 A 中 A.7。
3.8 酪蛋白琼脂:见附录 A 中 A.8。
3.9 硫酸锰营养琼脂培养基:见附录 A 中 A.9。
3.10 0.5%碱性复红:见附录 A 中 A.10。
3.11 动力培养基:见附录 A 中 A.11。
3.12 糖发酵管:见附录 A 中 A.12。
3.13 V-P 培养基:见附录 A 中 A.13。
3.14 胰酪胨大豆羊血(TSSB)琼脂:见附录 A 中 A.14。
3.15 溶菌酶营养肉汤:见附录 A 中 A.15。
3.16 西蒙氏柠檬酸盐培养基:见附录 A 中 A.16。
3.17 明胶培养基:见附录 A 中 A.17。
4 蜡样芽胞杆菌平板计数法(第一法)
4.1 检验程序
蜡样芽胞杆菌平板计数法检验程序见图 1。
图 1 蜡样芽胞杆菌平板计数法检验程序
图 1 蜡样芽胞杆菌平板计数法检验程序
4.2 操作步骤
4.2.1 样品处理
冷冻样品应在 45 ℃以下不超过 15 min 或在 2 ℃~5 ℃不超过 18 h 解冻,若不能及时检验,应放于
-10 ℃ ~-20 ℃保存;非冷冻而易腐的样品应尽可能及时检验,若不能及时检验,应置于 2 ℃~5 ℃冰箱
保存,24 h 内检验。
4.2.2 样品制备
称取样品 25 g,放入盛有 225 mL PBS 或生理盐水的无菌均质杯内,用旋转刀片式均质器以 8000
r/min~10000 r/min 均质 1 min~2 min,或放入盛有 225 mL PBS 或生理盐水的无菌均质袋中,用拍击式
均质器拍打 1 min~2 min。若样品为液态,吸取 25 mL 样品至盛有 225 mL PBS 或生理盐水的无菌锥形
瓶(瓶内可预置适当数量的无菌玻璃珠)中,振荡混匀,作为 1:10 的样品匀液。
4.2.3 样品的稀释
吸取 4.2.2 中 1:10 的样品匀液 1 mL 加到装有 9 mL PBS 或生理盐水的稀释管中,充分混匀制成 1:100
的样品匀液。跟据对样品污染状况的估计,按上述操作,依次制成十倍递增系列稀释样品匀液。每递增
稀释 1 次,换用 1 支 1mL 无菌吸管或吸头。
10 倍系列稀释
检样
25 g(或 25mL)样品+225 mL 稀释液,均质
选取 2 个~3 个适宜的连续稀释度的样品匀液,涂布
MYP 琼脂平板
典型菌落计数及确定鉴定
报 告
4.2.4 样品接种
根据对样品污染状况的估计,选择 2 个~3 个适宜稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),以 0.3
mL、0.3 mL、0.4 mL 接种量分别移入三块 MYP 琼脂平板,然后用无菌 L 棒涂布整个平板,注意不要触
及平板边缘。使用前,如 MYP 琼脂平板表面有水珠,可放在 25 ℃~50 ℃的培养箱里干燥,直到平板表
面的水珠消失。
4.2.5 分离、培养
4.2.5.1 分离
在通常情况下,涂布后,将平板静置 10 min。如样液不易吸收,可将平板放在培养箱 30 ℃±1 ℃培
养 1 h,等样品匀液吸收后翻转平皿,倒置于培养箱,30 ℃±1 ℃培养 24 h±2 h。如果菌落不典型,可继
淡粉红色沉淀环(表示产卵磷脂酶)。
4.2.5.2 纯培养
从每个平板(符合 4.4.1.1 要求的平板)中挑取至少 5 个典型菌落(小于 5 个全选),分别划线接种
于营养琼脂平板做纯培养,30 ℃±1 ℃培养 24 h±2 h,进行确证实验。在营养琼脂平板上,典型菌落为灰
白色,偶有黄绿色,不透明,表面粗糙似毛玻璃状或融蜡状,边缘常呈扩展状,直径为 4 mm~10 mm。
4.3 确定鉴定
4.3.1 染色镜检
挑取纯培养的单个菌落,革兰氏染色镜检。蜡样芽胞杆菌为革兰氏阳性芽胞杆菌,大小为(1 μm~
1.3 μm)×(3 μm~5 μm),芽胞呈椭圆形位于菌体中央或偏端,不膨大于菌体,菌体两端较平整,多呈
4.3.2 生化鉴定
4.3.2.1 概述
挑取纯培养的单个菌落,进行过氧化氢酶试验、动力试验、硝酸盐还原试验、酪蛋白分解试验、溶
菌酶耐性试验、V-P 试验、葡萄糖利用(厌氧)试验、根状生长试验、溶血试验、蛋白质毒素结晶试验。蜡
样芽胞杆菌生化特征与其他芽胞杆菌的区别见表 1。
表1 蜡样芽胞杆菌生化特征与其他芽胞杆菌的区别
项目
蜡样芽胞杆菌
Bacillus cereus
Bacillus
thuringiensis
蕈状芽胞杆菌
Bacillus
mycoides
炭疽芽胞杆菌
Bacillus anthracis
巨大芽胞杆菌
Bacillus megaterium
过氧化氢酶 + + + + +
动力 +/- +/- - - +/-
硝酸盐还原 + +/- + + -/+
酪蛋白分解 + + +/- -/+ +/-
溶菌酶耐性 + + + + -
卵黄反应 + + + + -
表 1 (续)
项目
蜡样芽胞杆菌
苏云金芽胞杆菌
Bacillus
thuringiensis
蕈状芽胞杆菌
Bacillus
mycoides
炭疽芽胞杆菌
Bacillus anthracis
巨大芽胞杆菌
葡萄糖利用(厌氧) + + + + -
V-P试验 + + + + -
甘露醇产酸 - - - - +
溶血(羊红细胞) + + + -/+ -
根状生长 - - + - -
蛋白质毒素晶体 - + - - -
注:+ 表示 90%~100%的菌株阳性;- 表示 90%~100%的菌株阴性;+/- 表示大多数的菌株阳性;-/+ 表示大多数的菌株
阴性。
4.3.2.2 动力试验
呈扩散生长,而蕈状芽孢杆菌常呈“绒毛状”生长。也可用悬滴法检查。
4.3.2.3 溶血试验
挑取纯培养的单个可疑菌落接种于 TSSB 琼脂平板上,30 ℃±1 ℃培养 24 h±2 h。蜡样芽胞杆菌菌落
为浅灰色,不透明,似白色毛玻璃状,有草绿色溶血环或完全溶血环。苏云金芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌
呈现弱的溶血现象,而多数炭疽芽胞杆菌为不溶血,巨大芽胞杆菌为不溶血。
4.3.2.4 根状生长试验
挑取单个可疑菌落按间隔2 cm~3 cm左右距离划平行直线于经室温干燥1d~2d的营养琼脂平板上,
30 ℃±1 ℃培养 24 h~48 h,不能超过 72h。用蜡样芽胞杆菌和蕈状芽胞杆菌标准株作为对照进行同步试
验。蕈状芽胞杆菌呈根状生长的特征。蜡样芽胞杆菌菌株呈粗糙山谷状生长的特征。
用接种环取纯菌悬液一环,接种于溶菌酶肉汤中,36 ℃±1 ℃培养 24 h。蜡样芽胞杆菌在本培养基
(含 0.001%溶菌酶)中能生长。如出现阴性反应,应继续培养 24 h。巨大芽胞杆菌不生长。
4.3.2.6 蛋白质毒素结晶试验
挑取纯培养的单个可疑菌落接种于硫酸锰营养琼脂平板上,30 ℃±1 ℃培养 24 h±2 h,并于室温放置
3 d~4 d,挑取培养物少许于载玻片上,滴加蒸馏水混匀并涂成薄膜。经自然干燥,微火固定后,加甲醇
作用 30 s 后倾去,再通过火焰干燥,于载玻片上滴满 0.5%碱性复红,放火焰上加热(微见蒸气,勿使染
液沸腾)持续 1 min~2 min,移去火焰,再更换染色液再次加温染色 30 s,倾去染液用洁净自来水彻底清
洗、晾干后镜检。观察有无游离芽胞(浅红色)和染成深红色的菱形蛋白结晶体。如发现游离芽胞形成
的不丰富,应再将培养物置室温 2 d~3 d 后进行检查。除苏云金芽胞杆菌外,其他芽胞杆菌不产生蛋白
4.3.3 生化分型(选做项目)
根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P 试验反应、明胶液化试验,将蜡样芽胞杆菌分
成不同生化型别,见表 2。
表 2 蜡样芽胞杆菌生化分型试验
型别
生化试验
柠檬酸盐 硝酸盐 淀粉 V-P 明胶
1 + + + + +
2 - + + + +
4 - - + + +
5 - - - + +
6 + - - + +
7 + - + + +
8 - + - + +
9 - + - - +
10 - + + - +
11 + + + - +
12 + + - - +
14 + - - - +
15 + - + - +
注:+表示 90%~100%的菌株阳性;-表示 90%~100%的菌株阴性。
4.4 结果计算
4.4.1 典型菌落计数和确认
4.4.1.1 选择有典型蜡样芽胞杆菌菌落的平板,且同一稀释度 3 个平板所有菌落数合计在 20 CFU~200
CFU 之间的平板,计数典型菌落数。如果出现 a)~f)现象按 4.4.2.1 中公式(1)计算,如果出现 g)现
象则按 4.4.2.2 中公式(2)计算;
a)只有一个稀释度的平板菌落数在 20 CFU~200 CFU 之间且有典型菌落,计数该稀释度平板上的
b)2 个连续稀释度的平板菌落数均在 20 CFU~200 CFU 之间,但只有一个稀释度的平板有典型菌
落,应计数该稀释度平板上的典型菌落;
c)所有稀释度的平板菌落数均小于 20 CFU 且有典型菌落,应计数最低稀释度平板上的典型菌落;
d)某一稀释度的平板菌落数大于 200 CFU 且有典型菌落,但下一稀释度平板上没有典型菌落,应
计数该稀释度平板上的典型菌落;
e)所有稀释度的平板菌落数均大于 200 CFU 且有典型菌落,应计数最高稀释度平板上的典型菌落;
f)所有稀释度的平板菌落数均不在 20 CFU~200 CFU 之间且有典型菌落,其中一部分小于 20 CFU
或大于 200 CFU 时,应计数最接近 20 CFU 或 200 CFU 的稀释度平板上的典型菌落。
g) 2 个连续稀释度的平板菌落数均在 20 CFU~200 CFU 之间且均有典型菌落。
30 ℃±1 ℃培养 24 h±2 h。
4.4.2 计算公式
4.4.2.1 菌落计算公式(1)
T =
Cd
AB
(1)
式中:
T--样品中蜡样芽胞杆菌菌落数;
B--鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数;
C--用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数;
d --稀释因子。
4.4.2.2 菌落计算公式(2)
(2)
式中:
T --样品中蜡样芽胞杆菌菌落数;
A1--第一稀释度(低稀释倍数)蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数;
A2--第二稀释度(高稀释倍数)蜡样芽胞杆菌典型菌落的总数;
B2--第二稀释度(高稀释倍数)鉴定结果为蜡样芽胞杆菌的菌落数;
C1--第一稀释度(低稀释倍数)用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数;
C2--第二稀释度(高稀释倍数)用于蜡样芽胞杆菌鉴定的菌落数;
1.1--计算系数(如果第二稀释度蜡样芽胞杆菌鉴定结果为 0,计算系数采用 1);
d --稀释因子(第一稀释度)。
4.5 结果与报告
4.5.1 根据 MYP 平板上蜡样芽胞杆菌的典型菌落数,按 4.4 中公式(1)、公式(2)计算,报告每 g(mL)
样品中蜡样芽胞杆菌菌数,以 CFU/g(mL)表示;如 T 值为 0,则以小于 1 乘以最低稀释倍数报告。
4.5.2 必要时报告蜡样芽胞杆菌生化分型结果。
5.1 检验程序
蜡样芽胞杆菌 MPN计数法检验程序见图 2。
.1d1
BA
BA
图 2 蜡样芽胞杆菌 MPN计数法检验程序
5.2 操作步骤
5.2.1 样品处理
同 4.2.1。
同 4.2.2。
5.2.3 样品的稀释
同 4.2.3。
5.2.4 样品接种
10 倍系列稀释
选取 3 个适宜连续稀释度的样品匀液,各吸取 1mL,分别接种于
3 管胰酪胨大豆多黏菌素肉汤
接种 MYP 琼脂平板
确定鉴定
检样
25 g(或 25mL)样品+225 mL 稀释液,均质
报告结果
30 ℃±1 ℃ 24 h~48 h
30 ℃±1 ℃ 48 h±2 h
取 3 个适宜连续稀释度的样品匀液(液体样品可包括原液),接种于 10 mL 胰酪胨大豆多黏菌素肉
汤中,每一稀释度接种 3 管,每管接种 1 mL(如果接种量需要超过 1 mL,则用双料胰酪胨大豆多黏菌
素肉汤)。于 30 ℃±1 ℃培养 48 h±2 h。
5.2.5 培养
落不典型,可继续培养 24 h±2 h 再观察。
5.2.6 确定鉴定
从每个平板选取 5个典型菌落(小于 5个全选),划线接种于营养琼脂平板做纯培养,30 ℃±1 ℃培
养 24 h±2 h,进行确证实验,见 4.3。
5.3 结果与报告
根据证实为蜡样芽胞杆菌阳性的试管管数,查 MPN 检索表(见附录 B),报告每 g(mL)样品中
蜡样芽胞杆菌的最可能数,以 MPN/g(mL)表示。
附录 A
培养基和试剂
A.1.1 成分
磷酸二氢钾 34.0 g
蒸馏水 500.0 mL
A.1.2 制法
贮存液:称取 34.0 g 的磷酸二氢钾溶于 500 mL 蒸馏水中,用大约 175 mL 的 1mol/L 氢氧化钠溶液
调节 pH 至 7.2,用蒸馏水稀释至 1000 mL 后贮存于冰箱。
稀释液:取贮存液 1.25 mL,用蒸馏水稀释至 1 000 mL,分装于适宜容器中,121 ℃高压灭菌 15 min。
A.2 甘露醇卵黄多黏菌素(MYP)琼脂
A.2.1 成分
牛肉粉 1.0 g
D-甘露醇 10.0 g
氯化钠 10.0 g
琼脂粉 12.0~15.0 g
0.2 %酚红溶液 13.0 mL
50 %卵黄液 50.0 mL
多黏菌素B 100,000 IU
蒸馏水 950.0 mL
A.2.2 制法
每瓶 95 mL,121 ℃高压灭菌 15 min。临用时加热溶化琼脂,冷却至 50 ℃,每瓶加入 50%卵黄液 5 mL
和浓度为 10000 IU 的多黏菌素 B 溶液 1 mL,混匀后倾注平板。
A.2.2.1 50 %卵黄液
取鲜鸡蛋,用硬刷将蛋壳彻底洗净,沥干,于 70%酒精溶液中浸泡 30 min。用无菌操作取出卵黄,
加入等量灭菌生理盐水,混匀后备用。
A.2.2.2 多黏菌素 B溶液
在 50 mL 灭菌蒸馏水中溶解 500 000 IU 的无菌硫酸盐多黏菌素 B。
A.3 胰酪胨大豆多黏菌素肉汤
A.3.1 成分
植物蛋白胨(或大豆蛋白胨) 3.0 g
氯化钠 5.0 g
无水磷酸氢二钾 2.5 g
葡萄糖 2.5 g
多黏菌素B 100 IU/mL
蒸馏水 1 000.0 mL
A.3.2 制法
将 A.3.1 前五种成分加入于蒸馏水中,加热溶解,校正 pH 至 7.3±0.2,121 ℃高压灭菌 15 min。临
用时加入多黏菌素 B 溶液混匀即可。多黏菌素 B 溶液制法同附录 A.2.2.2。
A.4.1 成分
蛋白胨 10.0 g
牛肉膏 5.0 g
氯化钠 5.0 g
琼脂粉 12.0~15.0 g
蒸馏水 1 000.0 mL
A.4.2 制法
将 A.4.1 所述成分溶解于蒸馏水内,校正 pH 至 7.2±0.2,加热使琼脂溶化。121℃高压灭菌 15 min,
备用。
A.5.1 试剂
3%过氧化氢溶液:临用时配制,用 H2O2配制。
A.5.2 试验方法
用细玻璃棒或一次性接种针挑取单个菌落, 置于洁净试管内,滴加 3%过氧化氢溶液 2 mL,观察结
果。
A.5.3 结果
于 30s 内发生气泡者为阳性,不发生气泡者为阴性。
A.6 动力培养基
A.6.1 成分
酵母粉 2.5 g
葡萄糖 5.0 g
无水磷酸氢二钠 2.5 g
琼脂粉 3.0 ~5.0g
蒸馏水 1 000.0 mL
A.6.2 制法
将 A.6.1 所述成分于蒸馏水,校正 pH 至 7.2±0.2,加热溶解。分装每管 2 mL~3 mL。115 ℃高压灭
菌 20 min,备用。
A.6.3 试验方法
线呈扩散生长,而蕈状芽胞杆菌常常呈绒毛状生长,形成蜂巢状扩散。动力试验也可用悬滴法检查。蜡
样芽胞杆菌和苏云金芽胞杆菌通常运动极为活泼,而炭疽杆菌则不运动。
A.7 硝酸盐肉汤
A.7.1 成分
蛋白胨 5.0 g
硝酸钾 0.2 g
蒸馏水 1 000.0 mL
A.7.2 制法
将 A.7.1 所述成分溶解于蒸馏水。校正 pH 至 7.4,分装每管 5 mL,121 ℃高压灭菌 15 min。
甲液:将对氨基苯磺酸 0.8 g 溶解于 2.5 mol/L 乙酸溶液 100 mL 中。
乙液:将甲萘胺 0.5 g 溶解于 2.5 mol/L 乙酸溶液 100 mL 中。
A.7.4 试验方法
接种后在 36 ℃±1 ℃培养 24 h~72 h。加甲液和乙液各 1 滴,观察结果,阳性反应立即或数分钟内
显红色。如为阴性,可再加入锌粉少许,如出现红色,表示硝酸盐未被还原,为阴性。反之,则表示硝
酸盐已被还原,为阳性。
A.8 酪蛋白琼脂
A.8.1 成分
酪蛋白 10.0 g
无水磷酸氢二钠 2.0 g
氯化钠 5.0 g
琼脂粉 12.0~15.0 g
蒸馏水 1 000.0 mL
0.4 %溴麝香草酚蓝溶液 12.5 mL
A.8.2 制法
除溴麝香草酚蓝溶液外,将 A.8.1 所述各成分溶于蒸馏水中加热溶解(酪蛋白不会溶解)。校正 pH
至 7.4±0.2,加入溴麝香草酚蓝溶液,121 ℃高压灭菌 15 min 后倾注平板。
A.8.3 试验方法
周围培养基应出现澄清透明区(表示产生酪蛋白酶)。阴性反应时应继续培养 72 h 再观察。
A.9 硫酸锰营养琼脂培养基
A.9.1 成分
胰蛋白胨 5.0 g
葡萄糖 5.0 g
酵母浸膏 5.0 g
磷酸氢二钾 4.0 g
3.08%硫酸锰(MnSO4·H2O) 1.0 mL
琼脂粉 12.0~15.0 g
A.9.2 制法
将 A.9.1 所述成分溶解于蒸馏水。校正 pH 至 7.2±0.2。121 ℃高压灭菌 15 min,备用。
A.10 0.5 % 碱性复红
A.10.1 成分
碱性复红 0.5 g
乙醇 20.0 mL
蒸馏水 80.0 mL
A.10.2 制法
取碱性复红 0.5 g 溶解于 20 mL 乙醇中,再用蒸馏水稀释至 100 mL ,滤纸过滤后储存备用。

GB 4789.14-2014
GB
NATIONAL STANDARD OF THE
PEOPLE’S REPUBLIC OF CHINA
National Food Safety Standard –
Food Microbiological Examination - Bacillus Cereus
ISSUED ON. DECEMBER 1, 2014
IMPLEMENTED ON. MAY 1, 2015
Issued by. National Health and Family Planning Commission of the
People’s Republic of China
Table of Contents
Foreword ... 3 
1 Scope ... 4 
2 Equipment and materials ... 4 
3 Culture media and reagents ... 4 
4 Plate count method of bacillus cereus (first method) ... 5 
5 MPN count method of bacillus cereus (second method) ... 12 
Annex A Culture media and reagents ... 15 
Annex B Retrieval table of bacillus cereus most probable numbers ... 23 
National Food Safety Standard –
Food Microbiological Examination - Bacillus Cereus
1 Scope
This Standard specifies the examination method of bacillus cereus in food.
The first method of this Standard applies to the count of bacillus cereus in food which
has a high content of bacillus cereus; and the second method applies to the count of
bacillus cereus in food which has a low content of bacillus cereus.
2 Equipment and materials
In addition to conventional sterilization and culture equipment for microbiology
laboratories, the other equipment and materials are as follows.
a) refrigerators. 2°C ~ 5°C;
b) thermostatic incubators. 30°C ± 1°C, 36°C ± 1°C;
c) homogenizers;
d) electronic balances. sensitivity 0.1 g;
e) sterile conical flasks. 100 mL, 500 mL;
f) sterile pipettes. 1 mL (having 0.01 mL scale), 10 mL (having 0.1 mL scale) or
micropipettes and tips;
g) sterile plates. diameter 90 mm;
h) sterile examination tubes. 18 mm ×180 mm;
i) microscopes. 10× ~ 100× (oil immersion lens);
j) L spreader.
3 Culture media and reagents
3.1 Phosphate buffer solution (PBS). see A.1 of Annex A.
3.2 Mannitol yolk polymyxin (MYP) agar. see A.2 of Annex A.
4.2.3 Sample dilution
Absorb 1 mL of the 1.10 sample homogeneous solution of 4.2.2 to add to a dilution
tube containing 9 mL of PBS or normal saline; fully mix up to make 1.100 sample
homogeneous solution. In accordance with the estimation of sample contamination
degree, operate as above and make into ten-fold incremental serial dilution sample
homogeneous solution in succession. After each dilution, replace one 1 mL sterile
pipette or tip.
4.2.4 Sample inoculation
In accordance with the estimation of sample contamination degree, select 2 ~ 3 sample
homogeneous solutions of appropriate dilution (liquid samples can include primary
liquid); transfer the inoculum sizes of 0.3 mL, 0.3 mL and 0.4 mL to three MYP agar
plates respectively; then use a sterile L spreader to apply them to the whole plates;
and pay attention to not touching the edge of the plates. Before use, if there are water
drops on the surface of the MYP agar plates, they can be placed in an incubator to dry
at 25°C ~ 50°C until the water drops on the surface of the plates disappear.
4.2.5 Isolation and culture
4.2.5.1 Isolation
Under normal conditions, allow plates to stand for 10 min after applying. If sample
solution is difficult to absorb, it can be placed in an incubator to culture for 1 h at 30°C
± 1°C; turn over plates after sample homogeneous solution is evenly absorbed; place
them upside down in the incubator; culture for 24 h ± 2 h at 30°C ± 1°C. If the colonies
are not typical, continue culturing for 24 h ± 2 h before observing. On MYP agar plates,
typical colonies are of a faint pink colour (indicating unfermented mannitol) and there
are white to pale orchid pink precipitation ring (indicating the production of lecithinase).
4.2.5.2 Pure culture
Select at least 5 typical colonies (select all if less than 5) from each plate (complying
with the requirements of 4.4.1.1); inoculate them by streaking in nutrient agar plates
nutrient agar plates, typical colonies are offwhite, occasionally yellowish green, non-
transparent, ground glass shaped or melting wax shaped in surface roughness, usually
flared on the edge and of diameter 4 mm ~ 10 mm.
4.3 Confirmatory appraisal
4.3.1 Dyeing microscopic examination
Pick single colonies of pure culture for Gram’s microscopic examination. Bacillus
cereus is Gram positive bacillus of size (1 μm ~ 1.3 μm) ×(3 μm ~ 5 μm); the spore is
oval which is located at the centre or one end of thallus, not expanding on thallus; both
ends of thallus are flat, normally arranged in the shape of short chains or long chains.
nutrient agar plates which are dried for 1 d ~ 2 d at room temperature; culture for 24 h
~ 48 h at 30°C ± 1°C, not exceeding 72 h. Use the standard strains of bacillus cereus
and bacillus mycoides as control to carry out synchronous test. Bacillus mycoides
shows the characteristics of root growth. Bacillus cereus shows the characteristics of
rough valley growth.
4.3.2.5 Lysozyme tolerance test
Use an inoculating loop to pick one loop of pure strain suspension to inoculate in a
lysozyme broth; culture for 24 h at 36°C ± 1°C. Bacillus cereus is capable of growing
in the medium (containing 0.001% of lysozyme). In case of any negative reaction,
4.3.2.6 Protein toxin crystal test
Pick single suspicious colonies of pure culture to inoculate on manganese sulfate
nutrient agar plates; culture for 24 h ± 2 h at 31°C ± 1°C; store for 3 d ~ 4 d at room
temperature; pick a little of culture to place on the glass slide; and add dropwise
distilled water to mix up and form a thin film. After natural drying and low fire fixation,
add methyl alcohol to act for 30 s before pour out; dry through a flame; drop 0.5% basic
fuchsin fully on the glass slide; place above a flame for heating (steam starts to show
but do not let dye solution boil) for 1 min ~ 2 min for 1 min ~ 2 min; remove the flame;
replace dye solution to heat for dyeing for 30 s once again; pour out dye solution and
drying in the air. Observe whether there are free spores (light red) and rhombic protein
crystals dyed into dark red. If the production of free spores is not rich, continue to store
culture for 2 d ~ 3 d at room temperature before examination. Except bacillus
thuringiensis, other bacilli do not generate protein crystals.
4.3.3 Biochemical typing (optional)
Bacillus cereus is classified into different biochemical types in accordance with citrate
utilization, nitrate reduction, amylolysis, V-P test reaction and gelatin liquefaction test.
See Table 2.
Annex A
A.1 Phosphate buffer solution (PBS)
A.1.1 Composition
Potassium dihydrogen phosphate 34.0 g
  Distilled water 500.0 mL
A.1.2 Preparation
Stock solution. weigh 34.0 g of potassium dihydrogen phosphate to dissolve in 500 mL
of distilled water; use about 175 mL of 1 mol/L sodium hydroxide solution to adjust pH
to 7.2; use distilled water to dilute to 1 000 mL before storing in a refrigerator.
Dilute solution. take 1.25 mL of stock solution; use distilled water to dilute to 1 000 mL;
A.2 Mannitol yolk polymyxin (MYP) agar
A.2.1 Composition
Peptone 10.0 g
Beef powder 1.0 g
D-mannitol 10.0 g
Sodium chloride 10.0 g
Agar powder 12.0 ~ 15.0 g
0.2% phenol red solution 13.0 mL
50% egg yolk emulsion 50.0 mL
Distilled water 950.0 mL
A.2.2 Preparation
Add the first five ingredients of A.2.1 to 950 mL of distilled water; heat to dissolve;
calibrate pH to 7.3 ± 0.1; add phenol red solution. Load in different bottles, 95 mL per
bottle; carry out autoclaved sterilization for 15 min at 121°C. Heat to dissolve agar
immediately before use; cool to 50°C; add 5 mL of 50% egg yolk emulsion and 1 mL
of polymyxin B of concentration 10,000 IU to each bottle; pour plate after mixing up.
A.2.2.1 50% egg yolk emulsion
Take fresh eggs; use hard brush to clean shell thoroughly; drain off; soak in 70%
of sterile normal saline; prepare for use after mixing up.
A.5.3 Result
It is positive if air bubbles are generated within 30 s; it is negative if no air bubble is
generated.
A.6 Motility medium
A.6.1 Composition
Casein tryptone (or casein peptone) 10.0 g
  Yeast powder 2.5 g
  Glucose 5.0 g
  Agar powder 3.0 ~ 5.0 g
  Distilled water 1,000.0 mL
A.6.2 Preparation
Dissolve the ingredients mentioned in A.6.1 in distilled water; calibrate pH to 7.2 ± 0.2;
heat to dissolve. Load 2 mL ~ 3 mL in each tube. Carry out autoclaved sterilization for
15 min at 121°C as standby.
A.6.3 Test method
Use an inoculating needle to pick culture to inoculate in a motility medium by puncture;
culture for 48 h ± 2 h at 30°C ± 1°C. Bacillus cereus shall grow diffusedly along the
honeycomb-shaped diffusion. Motility test can also be checked using the pendant-drop
method. Bacillus cereus and bacillus thuringiensis are usually more motile while
bacillus anthracis is not motile.
A.7 Nitrate broth
A.7.1 Ingredients
Peptone 5.0 g
  Potassium nitrate 0.2 g
  Distilled water 1,000.0 mL
A.7.2 Preparation
5 mL in each tube; carry out autoclaved sterilization for 15 min at 121°C.
A.7.3 Nitrate reduction reagent
Solution A. dissolve 0.8 g of sulfanilic acid in 100 mL of 2.5 mol/L acetic acid solution.
Solution B. dissolve 0.5 g of α-Naphthylamine in 100 mL of 2.5 mol/Lacetic acid
solution.
A.10 0.5% basic fuchsin
A.10.1 Composition
Basic fuchsin 0.5 g
Ethyl alcohol 20.0 mL
A.10.2 Preparation
Take 0.5 g of basic fuchsin to dissolve in 20 mL of ethyl alcohol; use distilled water to
dilute to 100 mL; use filter paper to filter for storage as standby.
A.11 Motility medium
A.11.1 Composition
Peptone 10.0 g
Beef extract 3.0 g
Agar 4.0 g
Sodium chloride 5.0 g
A.11.2 Preparation
Dissolve the ingredients mentioned in A.11.1 in distilled water. Calibrate pH to 7.2 ±0.2;
load in small test tubes; carry out autoclaved sterilization for 15 min at 121°C as
standby.
A.12 Sugar fermentation tube
A.12.1 Composition
Beef powder 5.0 g
Peptone 10.0 g
Sodium chloride 3.0 g
   
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