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GB 4789.36-2016

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标准详细信息 GB 4789.36-2016; GB4789.36-2016
中文名称: 食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验
英文名称: Microbiological examination of food hygiene--Examination of Escherichia coliO157: H7/MN
行业: 国家标准
中标分类: X09
发布日期: 2016-12-23
实施日期: 2017-06-23
旧标准 (被替代): GB/T 4789.36-2008
标准依据: National Health and Family Planning Commission Notice No.17 of 2016

GB 4789.36-2016
National Food Safety Standard -- Food Microbiological Examination -- Examination of Escherichia Coli O157:H7/MN
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验
大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局 发 布
前言
本标准代替GB/T 4789.36-2008《食品卫生微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验》。
本标准与GB/T 4789.36-2008相比,主要变化如下:
---标准名称修改为“食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验”;
---修改了标准的范围;
---修改了设备和材料;
---修改了培养基和生化反应的文字描述;
---删除“第二法 免疫磁珠捕获法的原理”;
---删除“第三法 全自动酶联荧光免疫分析仪筛选法”;
---删除“第四法 全自动病原菌检测系统筛选法”。
食品安全国家标准
食品微生物学检验
大肠埃希氏菌O157:H7/NM检验
1 范围
本标准规定了食品中大肠埃希氏菌O157:H7/NM(EscherichiacoliO157:H7/NM)的检验方法。
本标准适用于食品中大肠埃希氏菌O157:H7/NM的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2.1 恒温培养箱:36℃±1℃。
2.2 冰箱:2℃~5℃。
2.3 恒温水浴箱:46℃±1℃。
2.4 天平:感量0.1g、0.01g。
2.5 均质器。
2.6 显微镜:10倍~100倍。
2.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或移液器及吸头。
2.8 无菌均质杯或无菌均质袋:容量500mL。
2.9 无菌培养皿:直径90mm。
2.10 pH计或精密pH试纸。
2.11 长波紫外光灯:365nm,功率≤6W。
2.12 微量离心管:1.5mL或2.0mL。
2.13 磁板、磁板架、样品混合器。
2.14 微生物鉴定系统。
3 培养基和试剂
3.1 改良EC肉汤(mEC+n):见A.1。
3.2 改良山梨醇麦康凯琼脂(CT-SMAC):见A.2。
3.3 三糖铁琼脂(TSI):见A.3。
3.4 营养琼脂:见A.4。
3.5 半固体琼脂:见A.5。
3.6 月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-MUG(MUG-LST):见A.6。
3.7 氧化酶试剂:见A.7。
3.8 革兰氏染色液:见A.8。
3.9 PBS-Tween20洗液:见A.9。
3.10 亚碲酸钾(AR级)。
3.11 头孢克肟(Cefixime)。
3.12 大肠埃希氏菌O157显色培养基。
3.13 大肠埃希氏菌O157和H7诊断血清或O157乳胶凝集试剂。
3.14 鉴定试剂盒。
3.15 抗-E.coliO157免疫磁珠。
第一法 常规培养法
4 检验程序
大肠埃希氏菌O157:H7/NM常规培养法检验程序见图1。
图1 大肠埃希氏菌O157:H7/NM常规培养法检验程序
5 操作步骤
5.1 增菌
以无菌操作取检样25g(或25mL)加入到含有225mLmEC+n肉汤的均质袋中,在拍击式均质
器上连续均质1min~2min;或放入盛有225 mL mEC+n肉汤的均质杯中,8000r/min~
10000r/min均质1min~2min。36℃±1℃培养18h~24h。
5.2 分离
取增菌后的 mEC+n肉汤,划线接种于CT-SMAC平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上,
36℃±1℃培养18h~24h,观察菌落形态。在CT-SMAC平板上,典型菌落为圆形、光滑、较小的无色
菌落,中心呈现较暗的灰褐色;在大肠埃希氏菌 O157显色琼脂平板上的菌落特征按产品说明书进行
判定。
5.3 初步生化试验
在CT-SMAC和大肠埃希氏菌 O157显色琼脂平板上分别挑取5个~10个可疑菌落,分别接种
TSI琼脂,同时接种 MUG-LST肉汤,并用大肠埃希氏菌株(ATCC25922或等效标准菌株)做阳性对照
和大肠埃希氏菌 O157:H7(NCTC12900或等效标准菌株)做阴性对照,于36℃±1℃培养18h~
24h。必要时进行氧化酶试验和革兰氏染色。在TSI琼脂中,典型菌株为斜面与底层均呈黄色,产气或
不产气,不产生硫化氢(H2S)。置 MUG-LST肉汤管于长波紫外灯下观察,MUG阳性的大肠埃希氏菌
株应有荧光产生,MUG阴性的应无荧光产生,大肠埃希氏菌 O157:H7/NM 为 MUG试验阴性,无荧
光。挑取可疑菌落,在营养琼脂平板上分纯,于36℃±1℃培养18h~24h,并进行下列鉴定。
5.4.1 血清学试验
在营养琼脂平板上挑取分纯的菌落,用O157和H7诊断血清或O157乳胶凝集试剂作玻片凝集试
验。对于H7因子血清不凝集者,应穿刺接种半固体琼脂,检查动力,经连续传代3次,动力试验均阴
性,确定为无动力株。如使用不同公司生产的诊断血清或乳胶凝集试剂,应按照产品说明书进行。
5.4.2 生化试验
5.4.2.1 自营养琼脂平板上挑取菌落,进行生化试验。大肠埃希氏菌O157:H7/NM 生化反应特征见
表1。
表1 大肠埃希氏菌O157:H7/NM生化反应特征
生化试验 特征反应
山梨醇 阴性或迟缓发酵
靛基质 阳性
甲基红-伏普试验(MR-VP) MR阳性,VP阴性
氧化酶 阴性
西蒙氏柠檬酸盐 阴性
赖氨酸脱羧酶 阳性(紫色)
鸟氨酸脱羧酶 阳性(紫色)
纤维二糖发酵 阴性
棉子糖发酵 阳性
动力试验 有动力或无动力
5.4.2.2 如选择生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统,应从营养琼脂平板上挑取菌落,用稀释液制备成浊
度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或微生物鉴定系统进行鉴定。
5.4.3 毒力基因测定(可选项目)
样品中检出大肠埃希氏菌O157:H7或O157:NM时,如需要进一步检测Vero细胞毒素基因的存
在,可通过接种Vero细胞或HeLa细胞,观察细胞病变进行判定;也可使用基因探针检测或聚合酶链反
应(PCR)方法进行志贺毒素基因(stx1、stx2)、eae、hly等基因的检测。如使用试剂盒检测上述基因,应
按照产品的说明书进行。
6 结果报告
或大肠埃希氏菌O157:NM。
第二法 免疫磁珠捕获法
7 检验程序
大肠埃希氏菌O157:H7/NM免疫磁珠捕获法检验程序见图2。
图2 大肠埃希氏菌O157:H7/NM免疫磁珠捕获法检验程序
8 操作步骤
8.1 增菌
同5.1。
8.2 免疫磁珠捕获与分离
可能有偏差时,按生产商提供的使用说明进行。
8.2.2 将微量离心管按样品和质控菌株进行编号,每个样品使用1只微量离心管,然后插入到磁板架
上。在漩涡混合器上轻轻振荡E.coliO157免疫磁珠混悬液后,用开盖器打开每个微量离心管的盖子,
每管加入20μLE.coliO157免疫磁珠悬液。
8.2.3 取mEC+n肉汤增菌培养物1mL,加入到微量离心管中,盖上盖子,然后轻微振荡10s。每个
样品更换1只加样吸头,质控菌株必须与样品分开进行,避免交叉污染。
8.2.4 结合:在18℃~30℃环境中,将上述微量离心管连同磁板架放在样品混合器上转动或用手轻微
转动10min,使E.coliO157与免疫磁珠充分接触。
8.2.5 捕获:将磁板插入到磁板架中浓缩磁珠。在3min内不断地倾斜磁板架,确保悬液中与盖子上的
8.2.6 吸取上清液:取1支无菌加长吸管,从免疫磁珠聚集物对侧深入液面,轻轻吸走上清液。当吸到
液面通过免疫磁珠聚集物时,应放慢速度,以确保免疫磁珠不被吸走。如吸取的上清液内含有磁珠,则
应将其放回到微量离心管中,并重复8.2.5步骤。每个样品换用1支无菌加长吸管。
免疫磁珠的滑落:某些样品特别是那些富含脂肪的样品,其磁珠聚集物易于滑落到管底。在吸取上
清液时,很难做到不丢失磁珠,在这种情况下,可保留50μL~100μL上清液于微量离心管中。如果在
后续的洗涤过程中也这样做的话,脂肪的影响将减小,也可达到充分捕获的目的。
8.2.7 洗涤:从磁板架上移走磁板,在每个微量离心管中加入1mLPBS-Tween20洗液,放在样品混合
器上转动或用手轻微转动3min,洗涤免疫磁珠混合物。重复上述步骤8.2.5~8.2.7。
8.2.8 重复上述步骤8.2.5~8.2.6。
8.2.10 涂布平板:将免疫磁珠混匀,各取50μL免疫磁珠悬液分别转移至CT-SMAC平板和大肠埃希
氏菌O157显色琼脂平板一侧,然后用无菌涂布棒将免疫磁珠涂布平板的一半,再用接种环划线接种平
板的另一半。待琼脂表面水分完全吸收后,翻转平板,于36℃±1℃培养18h~24h。
注:若CT-SMAC平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板表面水分过多时,应在36℃±1℃下干燥10min~
20min,涂布时避免将免疫磁珠涂布到平板的边缘。
8.3 菌落识别
大肠埃希氏菌O157:H7/NM在CT-SMAC平板和大肠埃希氏菌O157显色琼脂平板上的菌落特
征同5.2。
8.4 初步生化试验
8.5 鉴定
同5.4。
9 结果报告
同第6章。
附 录 A
培养基和试剂
A.1 改良EC肉汤(mEC+n)
A.1.1 成分
胰蛋白胨 20.0g
乳糖 5.0g
K2HPO4·7H2O 4.0g
KH2PO4 1.5g
NaCl 5.0g
新生霉素钠盐溶液(20mg/mL) 1.0mL
蒸馏水 1000mL
A.1.2 制法
除新生霉素外,所有成分溶解在水中,加热煮沸,在20℃~25℃下校正pH至6.9±0.1,分装。于
121℃高压灭菌15min,备用。制备浓度为20mg/mL的新生霉素储备溶液,过滤法除菌。待培养基温
A.2 改良山梨醇麦康凯(CT-SMAC)琼脂
A.2.1 山梨醇麦康凯(SMAC)琼脂
A.2.1.1 成分
蛋白胨 20.0g
山梨醇 10.0g
3号胆盐 1.5g
氯化钠 5.0g
中性红 0.03g
结晶紫 0.001g
蒸馏水 1000mL
A.2.1.2 制法
除琼脂、结晶紫和中性红外,所有成分溶解在蒸馏水中,加热煮沸,在20℃~25℃下校正pH 至
7.2±0.2,加入琼脂、结晶紫和中性红,煮沸溶解,分装。于121℃高压灭菌15min。
A.2.2 亚碲酸钾溶液
A.2.2.1 成分
亚碲酸钾 0.5g
蒸馏水 200mL
A.2.2.2 制法
A.2.3 头孢克肟(Cefixime)溶液
A.2.3.1 成分
头孢克肟 1.0mg
95%乙醇 200mL
A.2.3.2 制法
将头孢克肟溶解于95%乙醇中,静置1h待其充分溶解后过滤除菌。分装试管,储存于-20℃,有
效期1年。解冻后的头孢克肟溶液不应再冻存,且在2℃~8℃下有效期14d。
A.2.4 CT-SMAC制法
取1000mL灭菌融化并冷却至46℃±1℃的山梨醇麦康凯(SMAC)琼脂,加入1mL亚碲酸钾溶
平板。
A.3 三糖铁琼脂(TSI)
A.3.1 成分
蛋白胨 20.0g
牛肉浸膏 5.0g
乳糖 10.0g
蔗糖 10.0g
葡萄糖 1.0g
硫酸亚铁铵[(NH4)2Fe(SO4)2·6H2O] 0.2g
硫代硫酸钠 0.2g
酚红 0.025g或5.0g/L溶液5.0mL
琼脂 12.0g
蒸馏水 1000mL
A.3.2 制法
除酚红和琼脂外,将其他成分加于400mL蒸馏水中,煮沸溶解,在20℃~25℃下校正pH至7.4
±0.2。另将琼脂加于600mL蒸馏水中,煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后,加入5%酚红水溶液5mL,混匀,分装小号试管,每管约2mL~4mL。
于121°C10min或115°C15min,制成高层斜面。冷却后呈桔红色。如不立即使用,在2℃~8℃条
A.4 营养琼脂
A.4.1 成分
蛋白胨 10.0g
牛肉膏 3.0g
氯化钠 5.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000mL
A.4.2 制法
将各成分溶解于蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,校正pH至7.4±0.2,分装。于121℃高压灭菌
A.5 半固体琼脂
A.5.1 成分
蛋白胨 1.0g
牛肉膏 0.3g
氯化钠 0.5g
琼脂 0.3g~0.4g
蒸馏水 100mL
A.5.2 制法
将各成分溶解于蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,校正pH至7.4±0.2,分装小试管,于121℃高压
A.6 月桂基硫酸盐蛋白胨肉汤-MUG(LST-MUG)
A.6.1 成分
胰蛋白胨 20.0g
氯化钠 5.0g
乳糖 5.0g
磷酸氢二钾 (K2HPO4) 2.75g
磷酸二氢钾(KH2PO4) 2.75g
十二烷基硫酸钠 0.1g
4-甲基伞形酮-β-D-葡萄糖醛酸苷(MUG) 0.1g
A.6.2 制法
将各成分溶解于蒸馏水中,加热煮沸至完全溶解,于20℃~25℃下校正pH至6.8±0.2,分装到带
有倒管的试管中,每管10mL,于121℃高压灭菌15min。
A.7 氧化酶试剂
A.7.1 成分
N,N'-二甲基对苯二胺盐酸盐
或N,N,N',N'-四甲基对苯二胺盐酸盐 1.0g
蒸馏水 100mL
A.7.2 制法
A.7.3 试验方法
用无菌棉拭子取单个菌落,滴加氧化酶试剂,10s内呈现粉红或紫红色,即为氧化酶试验阳性。不
变色者为氧化酶试验阴性。
A.8 革兰氏染色液
A.8.1 结晶紫染色液
A.8.1.1 成分
结晶紫 1.0g
95%乙醇 20mL
1%草酸铵水溶液 80mL
将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
A.8.2 革兰氏碘液
A.8.2.1 成分
碘 1.0g
碘化钾 2.0g
蒸馏水 300mL
A.8.2.2 制法
将碘与碘化钾先行混合,加入蒸馏水少许充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。
A.8.3 沙黄复染液
沙黄 0.25g
95%乙醇 10.0mL
蒸馏水 90.0mL
A.8.3.2 制法
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
A.8.4 染色法
A.8.4.1 涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染液,染1min,水洗。
A.8.4.2 滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。
A.8.4.3 滴加95%乙醇脱色约15s~30s,直至染色液被洗掉,不要过分脱色,水洗。
A.9 PBS-Tween20洗液
按照商品用E.coliO157免疫磁珠的洗液配方进行制备,或按照下列配方制备。
A.9.1 成分
氯化钠 8.0g
氯化钾 0.2g
磷酸氢二钠(Na2HPO4 1.15g
磷酸二氢钾(KH2PO4) 0.2g
Tween20 0.5g
蒸馏水 1000mL
将上述成分溶解于水中,于20℃~25℃下校正pH 至7.3±0.2,分装锥形瓶。121℃高压灭菌
15min,备用。


GB 4789.36-2016
GB
NATIONAL STANDARD OF THE
PEOPLE’S REPUBLIC OF CHINA
National Food Safety Standard -
Microbiological Examination of Food Hygiene
Examination of Escherichia Coli O157.H7/NM
食品卫生国家标准
食品微生物学检验
大肠埃希氏菌 O157.H7/NM 检验
ISSUED ON. DECEMBER 23, 2016
IMPLEMENTED ON. JUNE 23, 2017
Issued by. National Health and Family Planning Commission of the
People’s Republic of China;
China Food and Drug Administration.
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Table of Contents
Foreword ... 3 
1 Application Scope ... 4 
2 Apparatus and Materials ... 4 
3 Culture Media and Reagents ... 5 
4 Test Procedures ... 5 
5 Operating Procedures ... 6 
6 Result Reporting ... 8 
7 Test Procedures ... 8 
8 Operating Procedures ... 9 
9 Result Reporting ... 11 
Annex A Culture Media and Reagents ... 12 
Foreword
This Standard replaces GB/T 4789.36-2008, Microbiological Examination of Food
Hygiene – Examination of Escherichia Coli O157.H7/NM.
Compared with GB/T 4789.36-2008, the major changes of this Standard are as follows.
-- the standard name is modified into “National Food Safety Standard –
Microbiological Examination of Food Hygiene – Examination of Escherichia Coli
O157.H7/NM.”;
-- the application scope of the standard is modified;
-- the apparatus and materials are modified;
-- the text descriptions of culture media and biochemical reactions are modified;
-- “Method II The Principle of the Immunomagnetic Beads Capture Method” is
deleted;
-- “Method III Full-automatic Enzyme-linked Fluorescence Immunoassay
Instrument Screening Method” is deleted;
-- “Method IV Full-automatic Pathogenic Bacteria Detecting System Screening
Method” is deleted.
National Food Safety Standard -
Microbiological Examination of Food Hygiene
Examination of Escherichia Coli O157.H7/NM
1 Application Scope
This Standard specifies the test method of Escherichia coli o157.h7/nm in foods.
This Standard applies to the test of Escherichia coli o157.h7/nm in foods.
2 Apparatus and Materials
In addition to the conventional sterilization and culture equipment in the microbiological
laboratory, other apparatus and materials are as follows.
2.1 Thermostatic incubator. 36°C ± 1°C.
2.2 Refrigerator. 2°C ~ 5°C.
2.3 Thermostatic water bath. 46°C ± 1°C.
2.4 Balance. sensitivities 0.1 g and 0.01 g.
2.5 Homogenizer.
2.6 Microscope. 10X ~ 100X.
2.7 Sterile pipettes. 1 ml (having graduates of 0.01 ml), 10 ml (having graduates of
0.1 ml) or pipettes and tips.
2.8 Sterile homogeneous cups or sterile homogeneous bags. capacity 500 ml.
2.9 Sterile culture dishes. diameter 90 mm.
2.10 pH meters or precise pH test paper.
2.11 Long-wave UV lamps. 365 nm, power ≤ 6 W.
2.12 Microcentrifuge tubes. 1.5 ml or 2.0 ml.
2.13 Magnetic plate, magnetic plate frame, specimen mixer.
3 Culture Media and Reagents
3.1 Modified EC broth (mEC + n). see A.1.
3.2 Modified Sorbitol-MacConkey agar (CT-SMAC). see A.2.
3.3 Trisaccharide iron agar (TSI). see A.3.
3.4 Nutrient agar. see A.4.
3.5 Semi-solid agar. see A.5.
3.6 Lauryl sulphate peptone broth – MUG (MUG-LST). see A.6.
3.7 Oxidase reagent. see A.7.
3.8 Gram stain solution. see A.8.
3.10 Potassium tellurite (analytical reagent).
3.11 Cefixime.
3.12 Chromogenic medium for Escherichia coli O157.
3.13 Diagnostic serum for Escherichia coli O157 and H7 or latex agglutination
reagent for O157.
3.14 Identification kit.
3.15 Anti-E. coli O157 immunomagnetic beads.
Method I The Routine Culture Method
4 Test Procedures
O157. H7/NM.
Simmons citrate Negative
Lysine decarboxylase Positive (purple)
Ornithine decarboxylase Positive (purple)
Cellobiose fermentation Negative
Raffinose fermentation Positive
MUG test Negative (no fluorescence)
Dynamic test Dynamic or non-dynamic
5.4.2.2 If the biochemical identification kit or microbiological identification system is
bacterial suspension of appropriate turbidity and use the biochemical identification kit
or microbiological identification system for identification.
5.4.3 Virulence genes test (optional item)
When Escherichia coli O157. H7 or O157. NM is detected in the specimen, it may be
tested by inoculating Vero cells or Hela cells and observing the cytopathic effects if the
existence of Vero cytotoxin requires further tests; it may also be tested by using the
gene probe tests or polymerase chain reaction (PCR) method for Shiga toxin genes
(stx1 and stx2), eae, hly and so on. If kits are used for the test of the above-mentioned
genes, the product manuals shall be followed.
Summarize the biochemical and serological test results and report whether
Escherichia coli O157.H7 or Escherichia coli O157.NM is detected or not detected in
the 25 g (or 25 ml) of specimen.
Method II The Immunomagnetic Beads Capture
Method
7 Test Procedures
See Figure 2 for the test procedures of the immunomagnetic beads capture method of
Escherichia coli O157.H7/NM.
8.2.2 Number the microcentrifuge tubes in accordance with the specimens and
insert into the magnetic plate frame. Vibrate the Escherichia coli O157
immunomagnetic beads suspension gently on the vortex mixer, use an opener to open
the cap of each microcentrifuge tube, and add 20 μL of Escherichia coli O157
immunomagnetic beads suspension in each tube.
8.2.3 Take 1 ml of mEC+n broth enrichment medium, add to the microcentrifuge tube,
put on the cap, and then vibrate gently for 10 s. Replace one specimen adding tip for
each specimen, and the quality-control strains shall be separated from the specimen
to prevent cross-contamination.
8.2.4 Binding. at 18°C ~ 30°C, rotate the above-mentioned microcentrifuge tube
gently for 10 min to make Escherichia coli O157 fully contact with the immunomagnetic
beads.
8.2.5 Capture. insert the magnetic plate into the concentrated magnetic beads in the
magnetic plate frame. Tilt the magnetic plate frame within 3 min to ensure the
immunomagnetic beads in the suspension and on the cap are fully collected. Then,
rounded or oval brown accumulation becomes visible in the middle of the wall of the
microcentrifuge tubes.
8.2.6 Absorption of supernatant. take one sterile elongated pipette and absorb gently
the supernatant by inserting deep into the liquid from the immunomagnetic beads
level passes through the immunomagnetic accumulation, slow down to ensure no
immunomagnetic beads are absorbed away. If the supernatant absorbed contains
magnetic beads, place them back in the microcentrifuge tube, and repeat the
procedures in 8.2.5. Replace one sterile elongated tube for each specimen.
Fall of immunomagnetic beads. the magnetic beads accumulation of some specimens,
especially those specimens containing much fat is liable to fall to the bottom. When
absorbing the supernatant, it is hard to prevent the loss of magnetic beads; and under
such circumstances, 50 μL ~ 100 μL of supernatant may be reserved in the
microcentrifuge tube. If it is operated like this in the later washing process, the effects
8.2.7 Washing. move away the magnetic plate from the frame, add 1 ml of PBS-
Tween 20 lotion in each microcentrifuge tube, and rotate on a specimen mixer or use
hand to rotate gently for 3 min to wash the immunomagnetic beads mixture. Repeat
the above-mentioned procedures 8.2.5 ~ 8.2.7.
8.2.8 Repeat the above-mentioned procedures 8.2.5 ~ 8.2.6.
8.2.9 Immunomagnetic beads suspension. move away the magnetic plate and make
the immunomagnetic beads suspend in 100 μL of PBS-Tween 20 lotion once again.
Annex A
Culture Media and Reagents
A.1.1 Ingredients
Tryptone 20.0 g
Bile salt No.3 1.12 g
Lactose 5.0 g
K2HPO4·7H2O 4.0 g
KH2PO4 1.5 g
NaCl 5.0 g
Novobiocin sodium salt solution (20 mg/ml) 1.0 ml
Distilled water 1 000 ml
Except novobiocin, dissolve all ingredients in the water, heat to boiling, calibrate the
pH to 6.9 ± 0.1 at 20°C ~ 25°C, and load separately. Conduct autoclaved sterilization
for 15 min at 121°C as standby. Prepare novobiocin stock solution of concentration 20
mg/ml and conduct disinfection by filtering. Wait until the temperature ...
   
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