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GB 4789.4-2016

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标准编号: GB 4789.4-2016 (GB4789.4-2016)
中文名称: 食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验
英文名称: National food safety standard Food microbiological examination: Salmonella
行业: 国家标准
中标分类: X09
发布日期: 2016-12-23
实施日期: 2017-06-23
旧标准 (被替代): GB 4789.4-2010; SN 0170-1992; SN/T 2552.5-2010
标准依据: 国家卫生和计划生育委员会公告2016年第17号

GB 4789.4-2016
National food safety standard Food microbiological examination: Salmonella
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验 沙门氏菌检验
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局 发 布
前言
本标准代替 GB 4789.4-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验》、
SN0170-1992《出口食品沙门氏菌属(包括亚利桑那菌)检验方法》、SN/T 2552.5-2010《乳及乳制品卫
生微生物学检验方法 第5部分:沙门氏菌检验》。
整合后的标准与GB 4789.4-2010相比,主要变化如下:
---修改了检测流程和血清学检测操作程序;
---修改了附录A和附录B。
食品安全国家标准
食品微生物学检验 沙门氏菌检验
1 范围
本标准规定了食品中沙门氏菌(Salmonella)的检验方法。
本标准适用于食品中沙门氏菌的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2.1 冰箱:2℃~5℃。
2.2 恒温培养箱:36℃±1℃,42℃±1℃。
2.3 均质器。
2.4 振荡器。
2.5 电子天平:感量0.1g。
2.6 无菌锥形瓶:容量500mL,250mL。
2.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。
2.8 无菌培养皿:直径60mm,90mm。
2.9 无菌试管:3mm×50mm、10mm×75mm。
2.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2.11 全自动微生物生化鉴定系统。
2.12 无菌毛细管。
3 培养基和试剂
3.1 缓冲蛋白胨水(BPW):见A.1。
3.2 四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液:见A.2。
3.3 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液:见A.3。
3.4 亚硫酸铋(BS)琼脂:见A.4。
3.5 HE琼脂:见A.5。
3.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂:见A.6。
3.7 沙门氏菌属显色培养基。
3.8 三糖铁(TSI)琼脂:见A.7。
3.9 蛋白胨水、靛基质试剂:见A.8。
3.10 尿素琼脂(pH7.2):见A.9。
3.11 氰化钾 (KCN)培养基:见A.10。
3.12 赖氨酸脱羧酶试验培养基:见A.11。
3.13 糖发酵管:见A.12。
3.14 邻硝基酚β-D半乳糖苷(ONPG)培养基:见A.13。
3.15 半固体琼脂:见A.14。
3.16 丙二酸钠培养基:见A.15。
3.17 沙门氏菌O、H和Vi诊断血清。
3.18 生化鉴定试剂盒。
4 检验程序
沙门氏菌检验程序见图1。
图1 沙门氏菌检验程序
5 操作步骤
5.1 预增菌
无菌操作称取25g(mL)样品,置于盛有225mLBPW的无菌均质杯或合适容器内,以8000r/min~
10000r/min均质1min~2min,或置于盛有225mLBPW 的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打
1min~2min。若样品为液态,不需要均质,振荡混匀。如需调整pH,用1mol/mL无菌 NaOH 或
HCl调pH至6.8±0.2。无菌操作将样品转至500mL锥形瓶或其他合适容器内(如均质杯本身具有无
孔盖,可不转移样品),如使用均质袋,可直接进行培养,于36℃±1℃培养8h~18h。
如为冷冻产品,应在45℃以下不超过15min,或2℃~5℃不超过18h解冻。
5.2 增菌
轻轻摇动培养过的样品混合物,移取1mL,转种于10mLTTB内,于42℃±1℃培养18h~24h。
同时,另取1mL,转种于10mLSC内,于36℃±1℃培养18h~24h。
5.3 分离
分别用直径3mm的接种环取增菌液1环,划线接种于一个BS琼脂平板和一个XLD琼脂平板(或HE
琼脂平板或沙门氏菌属显色培养基平板),于36℃±1℃分别培养40h~48h(BS琼脂平板)或18h~24h
(XLD琼脂平板、HE琼脂平板、沙门氏菌属显色培养基平板),观察各个平板上生长的菌落,各个平板
上的菌落特征见表1。
表1 沙门氏菌属在不同选择性琼脂平板上的菌落特征
选择性琼脂平板 沙门氏菌
BS琼脂
菌落为黑色有金属光泽、棕褐色或灰色,菌落周围培养基可呈黑色或棕色;有些菌株形成灰绿
色的菌落,周围培养基不变
HE琼脂 蓝绿色或蓝色,多数菌落中心黑色或几乎全黑色;有些菌株为黄色,中心黑色或几乎全黑色
XLD琼脂
的菌落;有些菌株为黄色菌落,带或不带黑色中心
沙门氏菌属显色培
养基
按照显色培养基的说明进行判定
5.4 生化试验
5.4.1 自选择性琼脂平板上分别挑取2个以上典型或可疑菌落,接种三糖铁琼脂,先在斜面划线,再于
底层穿刺;接种针不要灭菌,直接接种赖氨酸脱羧酶试验培养基和营养琼脂平板,于36℃±1℃培养
18h~24h,必要时可延长至48h。在三糖铁琼脂和赖氨酸脱羧酶试验培养基内,沙门氏菌属的反应结
果见表2。
三糖铁琼脂
斜面 底层 产气 硫化氢
赖氨酸脱羧酶试验培养基 初步判断
K A +(-) +(-) + 可疑沙门氏菌属
K A +(-) +(-) - 可疑沙门氏菌属
A A +(-) +(-) + 可疑沙门氏菌属
A A +/- +/- - 非沙门氏菌
K K +/- +/- +/- 非沙门氏菌
注:K:产碱,A:产酸;+:阳性,-:阴性;+(-):多数阳性,少数阴性;+/-:阳性或阴性。
尿素琼脂(pH7.2)、氰化钾(KCN)培养基,也可在初步判断结果后从营养琼脂平板上挑取可疑菌落接
种。于36℃±1℃培养18h~24h,必要时可延长至48h,按表3判定结果。将已挑菌落的平板储存
于2℃~5℃或室温至少保留24h,以备必要时复查。
表3 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
反应序号 硫化氢 (H2S) 靛基质 pH7.2尿素 氰化钾(KCN) 赖氨酸脱羧酶
A1 + - - - +
A2 + + - - +
A3 - - - - +/-
注:+阳性;-阴性;+/-阳性或阴性。
常,按表4可判定为沙门氏菌。如有2项异常为非沙门氏菌。
表4 沙门氏菌属生化反应初步鉴别表
pH7.2尿素 氰化钾(KCN) 赖氨酸脱羧酶 判定结果
- - -
甲型副伤寒沙门氏菌(要
求血清学鉴定结果)
- + +
沙门氏菌Ⅳ或Ⅴ(要求符
合本群生化特性)
沙门氏菌个别变体(要求
血清学鉴定结果)
注:+表示阳性;-表示阴性。
5.4.2.2 反应序号A2:补做甘露醇和山梨醇试验,沙门氏菌靛基质阳性变体两项试验结果均为阳性,但
需要结合血清学鉴定结果进行判定。
5.4.2.3 反应序号A3:补做ONPG。ONPG阴性为沙门氏菌,同时赖氨酸脱羧酶阳性,甲型副伤寒沙
门氏菌为赖氨酸脱羧酶阴性。
5.4.2.4 必要时按表5进行沙门氏菌生化群的鉴别。
表5 沙门氏菌属各生化群的鉴别
卫矛醇 + + - - + -
山梨醇 + + + + + -
水杨苷 - - - + - -
ONPG - - + - + -
丙二酸盐 - + + - - -
KCN - - - + + -
注:+表示阳性;-表示阴性。
5.4.3 如选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统,可根据5.4.1的初步判断结果,从营养琼
脂平板上挑取可疑菌落,用生理盐水制备成浊度适当的菌悬液,使用生化鉴定试剂盒或全自动微生物生
5.5 血清学鉴定
5.5.1 检查培养物有无自凝性
一般采用1.2%~1.5%琼脂培养物作为玻片凝集试验用的抗原。首先排除自凝集反应,在洁净的
玻片上滴加一滴生理盐水,将待试培养物混合于生理盐水滴内,使成为均一性的混浊悬液,将玻片轻轻
摇动30s~60s,在黑色背景下观察反应(必要时用放大镜观察),若出现可见的菌体凝集,即认为有自
凝性,反之无自凝性。对无自凝的培养物参照下面方法进行血清学鉴定。
5.5.2 多价菌体抗原(O)鉴定
在玻片上划出2个约1cm×2cm的区域,挑取1环待测菌,各放1/2环于玻片上的每一区域上部,
在其中一个区域下部加1滴多价菌体(O)抗血清,在另一区域下部加入1滴生理盐水,作为对照。再用
景进行观察,任何程度的凝集现象皆为阳性反应。O血清不凝集时,将菌株接种在琼脂量较高的(如
2%~3%)培养基上再检查;如果是由于Vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时,可挑取菌苔于1mL生
理盐水中做成浓菌液,于酒精灯火焰上煮沸后再检查。
5.5.3 多价鞭毛抗原(H)鉴定
操作同5.5.2。H抗原发育不良时,将菌株接种在0.55%~0.65%半固体琼脂平板的中央,待菌落
蔓延生长时,在其边缘部分取菌检查;或将菌株通过接种装有0.3%~0.4%半固体琼脂的小玻管1次~
2次,自远端取菌培养后再检查。
5.6 血清学分型(选做项目)
5.6.1 O抗原的鉴定
株,不能分型。
被A~F多价O血清凝集者,依次用O4;O3、O10;O7;O8;O9;O2和O11因子血清做凝集试验。
根据试验结果,判定O群。被O3、O10血清凝集的菌株,再用O10、O15、O34、O19单因子血清做凝集
试验,判定E1、E4各亚群,每一个O抗原成分的最后确定均应根据O单因子血清的检查结果,没有O
单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对。
不被A~F多价O血清凝集者,先用9种多价O血清检查,如有其中一种血清凝集,则用这种血清
所包括的O群血清逐一检查,以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下:
O多价1 A,B,C,D,E,F群 (并包括6,14群)
O多价2 13,16,17,18,21群
O多价4 40,41,42,43群
O多价5 44,45,47,48群
O多价6 50,51,52,53群
O多价7 55,56,57,58群
O多价8 59,60,61,62群
O多价9 63,65,66,67群
5.6.2 H抗原的鉴定
属于A~F各O群的常见菌型,依次用表6所述H因子血清检查第1相和第2相的H抗原。
表6 A~F群常见菌型 H抗原表
C1
C2
D(不产气的)
D(产气的)
E1
E4
E4
g,f,s
i,b,d
b,d,r
g,m,p,q
h,v
g,s,t
5,z15
2,5
6,w,x
不常见的菌型,先用8种多价H血清检查,如有其中一种或两种血清凝集,则再用这一种或两种血
清所包括的各种H因子血清逐一检查,以第1相和第2项的 H抗原。8种多价 H血清所包括的 H因
H多价1 a,b,c,d,i
H多价2 eh,enx,enz15,fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gz51
H多价3 k,r,y,z,z10,lv,lw,lz13,lz28,lz40
H多价4 1,2;1,5;1,6;1,7;z6
H多价5 z4z23,z4z24,z4z32,z29,z35,z36,z38
H多价6 z39,z41,z42,z44
H多价7 z52,z53,z54,z55
H多价8 z56,z57,z60,z61,z62
每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果,没有 H单因子血清的要用两
检出第1相H抗原而未检出第2相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的,可
在琼脂斜面上移种1代~2代后再检查。如仍只检出一个相的 H抗原,要用位相变异的方法检查其另
一个相。单相菌不必做位相变异检查。
位相变异试验方法如下:
简易平板法:将0.35%~0.4%半固体琼脂平板烘干表面水分,挑取因子血清1环,滴在半固体平板
表面,放置片刻,待血清吸收到琼脂内,在血清部位的中央点种待检菌株,培养后,在形成蔓延生长的菌
苔边缘取菌检查。
小玻管法:将半固体管(每管约1mL~2mL)在酒精灯上溶化并冷至50℃,取已知相的 H因子血
清0.05mL~0.1mL,加入于溶化的半固体内,混匀后,用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻
以防琼脂中水分蒸发而干缩,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可以从另一端挑取细菌进行检查。
培养基内血清的浓度应有适当的比例,过高时细菌不能生长,过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般
按原血清1∶200~1∶800的量加入。
小倒管法:将两端开口的小玻管(下端开口要留一个缺口,不要平齐)放在半固体管内,小玻管的上
端应高出于培养基的表面,灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化,冷至50℃,挑取因子血清1环,
加入小套管中的半固体内,略加搅动,使其混匀,待凝固后,将待检菌株接种于小套管中的半固体表层
内,每天检查结果,待另一相细菌解离后,可从套管外的半固体表面取菌检查,或转种1%软琼脂斜面,
于36℃培养后再做凝集试验。
5.6.3 Vi抗原的鉴定
门氏菌。
5.6.4 菌型的判定
根据血清学分型鉴定的结果,按照附录B或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型。
6 结果与报告
综合以上生化试验和血清学鉴定的结果,报告25g(mL)样品中检出或未检出沙门氏菌。
附 录 A
培养基和试剂
A.1 缓冲蛋白胨水(BPW)
A.1.1 成分
氯化钠 5.0g
磷酸氢二钠(含12个结晶水) 9.0g
磷酸二氢钾 1.5g
蒸馏水 1000mL
A.1.2 制法
将各成分加入蒸馏水中,搅混均匀,静置约10min,煮沸溶解,调节pH至7.2±0.2,高压灭菌121℃,
15min。
A.2 四硫磺酸钠煌绿(TTB)增菌液
A.2.1 基础液
牛肉膏 5.0g
氯化钠 3.0g
碳酸钙 45.0g
蒸馏水 1000mL
除碳酸钙外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,再加入碳酸钙,调节pH至7.0±0.2,高压灭菌121℃,
20min。
A.2.2 硫代硫酸钠溶液
硫代硫酸钠(含5个结晶水) 50.0g
蒸馏水 加至100mL
A.2.3 碘溶液
碘 片 20.0g
碘化钾 25.0g
蒸馏水 加至100mL
将碘化钾充分溶解于少量的蒸馏水中,再投入碘片,振摇玻瓶至碘片全部溶解为止,然后加蒸馏水
至规定的总量,贮存于棕色瓶内,塞紧瓶盖备用。
A.2.4 0.5%煌绿水溶液
煌绿 0.5g
蒸馏水 100mL
A.2.5 牛胆盐溶液
牛胆盐 10.0g
蒸馏水 100mL
加热煮沸至完全溶解,高压灭菌121℃,20min。
A.2.6 制法
基础液 900mL
硫代硫酸钠溶液 100mL
碘溶液 20.0mL
煌绿水溶液 2.0mL
临用前,按上列顺序,以无菌操作依次加入基础液中,每加入一种成分,均应摇匀后再加入另一种
成分。
A.3 亚硒酸盐胱氨酸(SC)增菌液
A.3.1 成分
蛋白胨 5.0g
乳糖 4.0g
磷酸氢二钠 10.0g
亚硒酸氢钠 4.0g
L-胱氨酸 0.01g
A.3.2 制法
除亚硒酸氢钠和L-胱氨酸外,将各成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,冷至55℃以下,以无菌操作加入
亚硒酸氢钠和1g/LL-胱氨酸溶液10mL(称取0.1gL-胱氨酸,加1mol/L氢氧化钠溶液15mL,使溶
解,再加无菌蒸馏水至100mL即成,如为DL-胱氨酸,用量应加倍)。摇匀,调节pH至7.0±0.2。
A.4 亚硫酸铋(BS)琼脂
A.4.1 成分
蛋白胨 10.0g
牛肉膏 5.0g
葡萄糖 5.0g
磷酸氢二钠 4.0g
煌绿 0.025g或5.0g/L水溶液5.0mL
柠檬酸铋铵 2.0g
亚硫酸钠 6.0g
琼脂 18.0g~20.0g
蒸馏水 1000mL
A.4.2 制法
将前三种成分加入300mL蒸馏水(制作基础液),硫酸亚铁和磷酸氢二钠分别加入20mL和30mL蒸馏
水中,柠檬酸铋铵和亚硫酸钠分别加入另一20mL和30mL蒸馏水中,琼脂加入600mL蒸馏水中。然
将柠檬酸铋铵和亚硫酸钠混匀,倒入基础液中,再混匀。调节pH至7.5±0.2,随即倾入琼脂液中,混合
均匀,冷至50℃~55℃。加入煌绿溶液,充分混匀后立即倾注平皿。
注:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,贮于室温暗处,超过48h会降低其
选择性,本培养基宜于当天制备,第二天使用。
A.5 HE 琼脂(HektoenEntericAgar)
A.5.1 成分
蛋白胨 12.0g
牛肉膏 3.0g
乳糖 12.0g
水杨素 2.0g
胆盐 20.0g
氯化钠 5.0g
琼脂 18.0g~20.0g
蒸馏水 1000mL
0.4%溴麝香草酚蓝溶液 16.0mL
Andrade指示剂 20.0mL
甲液 20.0mL
乙液 20.0mL
将前面七种成分溶解于400mL蒸馏水内作为基础液;将琼脂加入于600mL蒸馏水内。然后分别
搅拌均匀,煮沸溶解。加入甲液和乙液于基础液内,调节pH至7.5±0.2。再加入指示剂,并与琼脂液
合并,待冷至50℃~55℃倾注平皿。
注:①本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性。
②甲液的配制
硫代硫酸钠 34.0g
柠檬酸铁铵 4.0g
蒸馏水 100mL
③乙液的配制
蒸馏水 100mL
④Andrade 指示剂
酸性复红 0.5g
1mol/L氢氧化钠溶液 16.0mL
蒸馏水 100mL
将复红溶解于蒸馏水中,加入氢氧化钠溶液。数小时后如复红褪色不全,再加氢氧化钠溶液1mL~
2mL。
A.6 木糖赖氨酸脱氧胆盐(XLD)琼脂
A.6.1 成分
L-赖氨酸 5.0g
木糖 3.75g
乳糖 7.5g
蔗糖 7.5g
去氧胆酸钠 2.5g
柠檬酸铁铵 0.8g
硫代硫酸钠 6.8g
氯化钠 5.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000mL
A.6.2 制法
除酚红和琼脂外,将其他成分加入400mL蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH至7.4±0.2。另将琼脂加
入600mL蒸馏水中,煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂,待冷至50℃~55℃倾注平皿。
注:本培养基不需要高压灭菌,在制备过程中不宜过分加热,避免降低其选择性,贮于室温暗处。本培养基宜于当
天制备,第二天使用。
A.7 三糖铁(TSI)琼脂
A.7.1 成分
牛肉膏 5.0g
乳 糖 10.0g
蔗 糖 10.0g
葡萄糖 1.0g
硫酸亚铁铵(含6个结晶水) 0.2g
酚红 0.025g或5.0g/L溶液5.0mL
氯化钠 5.0g
硫代硫酸钠 0.2g
琼脂 12.0g
A.7.2 制法
除酚红和琼脂外,将其他成分加入400mL蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH至7.4±0.2。另将琼脂加
入600mL蒸馏水中,煮沸溶解。
将上述两溶液混合均匀后,再加入指示剂,混匀,分装试管,每管约2mL~4mL,高压灭菌121℃
10min或115℃15min,灭菌后制成高层斜面,呈桔红色。
A.8 蛋白胨水、靛基质试剂
A.8.1 蛋白胨水
蛋白胨(或胰蛋白胨) 20.0g
氯化钠 5.0g
将上述成分加入蒸馏水中,煮沸溶解,调节pH至7.4±0.2,分装小试管,121℃高压灭菌15min。
A.8.2 靛基质试剂
A.8.2.1 柯凡克试剂:将5g对二甲氨基甲醛溶解于75mL戊醇中,然后缓慢加入浓盐酸25mL。
A.8.2.2 欧-波试剂:将1g对二甲氨基苯甲醛溶解于95mL95%乙醇内。然后缓慢加入浓盐酸
20mL。
A.8.3 试验方法
挑取小量培养物接种,在36℃±1℃培养1d~2d,必要时可培养4d~5d。加入柯凡克试剂约
0.5mL,轻摇试管,阳性者于试剂层呈深红色;或加入欧-波试剂约0.5mL,沿管壁流下,覆盖于培养液
表面,阳性者于液面接触处呈玫瑰红色。

GB 4789.4-2016
GB
NATIONAL STANDARD OF THE
PEOPLE’S REPUBLIC OF CHINA
National Food Safety Standard – Food
Microbiological Examination – Salmonella Test
食品安全国家标准 食品微生物学检验 沙门氏菌检验
ISSUED ON. DECEMBER 23, 2016
IMPLEMENTED ON. JUNE 23, 2017
Issued by. National Health and Family Planning Commission of PRC;
China Food and Drug Administration
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Table of Contents
Foreword ... 3
1 Scope ... 4
2 Devices and Materials ... 4
3 Medium and Reagent ... 5
4 Test Procedures ... 5
5 Operation Procedures ... 7
6 Results and Reports ... 13
Appendix A Medium and Reagent ... 14
Appendix B Common Salmonella Antigens ... 26
Foreword
This Standard replaced GB 4789.4-2010 National Food Safety Standard – Food
Microbiological Examination – Salmonella Test, SN 0170-1992 Method for Detection
of Salmonella (Including Arizona) in Food for Export, and SN/T 2552.5-2010
Microbiological Examination Method for Milk and Milk Products Hygiene – Part 5.
Detection of Salmonella.
Compared with GB 4789.4-2010, the combined standard has the major changes as
follows.
--- Modify the detection process and serological detection operation procedures;
--- Modify the Appendix A and Appendix B.
National Food Safety Standard – Food
Microbiological Examination – Salmonella Test
1 Scope
This Standard specifies the detection method of Salmonella in food.
This Standard is applicable to the test of salmonella in food.
2 Devices and Materials
In addition to the microbial laboratory routine sterilization and cultivation device, other
devices and materials are as follows.
2.1 Refrigerator. 2°C~5°C.
2.2 Constant temperature incubator. 36°C±1°C, 42°C±1°C.
2.3 Homogenizer.
2.4 Oscillator.
2.5 Electronic balance. sensitivity 0.1g.
2.6 Sterile conical flask. capacity of 500mL and 250mL.
2.7 Sterile pipettes. 1mL (with 0.01mL scale), 10ml (with 0.1ml scale) or micro pipette
and sucker.
2.8 Sterile culture dish. diameter of 60mm and 90mm.
2.9 Sterile test tube. 3mm × 50mm, 10mm × 75mm.
2.10 pH meter or pH colorimetric tube or precision pH test paper.
2.11 Automatic microbe biochemical identification system.
2.12 Sterile capillary tube.
3 Medium and Reagent
3.1 Buffer Petone Water (BPW). see A.1.
3.2 Tetrathionate Broth (TTB). see A.2.
3.3 Selenite Cystine (SC) Broth. see A.3.
3.4 Bismuth Sulfite (BS) Agar. see A.4.
3.5 HE agar. see A.5.
3.6 Xylose lysine Desoxycholate (XLD) Agar. see A.6.
3.7 Salmonella chromogenic medium.
3.8 Triple Sugar Iron (TSI) Agar. see A.7.
3.9 Petone water, indole reagent. see A.8.
3.10 Urea agar (pH7.2). see A.9.
3.11 Potassium cyanide (KCN) medium. see A.10.
3.12 Lysine decarboxylase test medium. see A.11.
3.13 Sugar fermentation tube. see A.12.
3.15 Semi-solid agar. see A.14.
3.16 Sodium malonate medium. see A.15.
3.17 Salmonella O, H and Vi diagnosed serum.
3.18 Biochemical identification reagent kit.
4 Test Procedures
Salmonella test procedure is shown in Figure 1.
Generally, use 1.2%~1.5% agar culture as the antigens for the slide agglutination test.
Firstly, remove the self-agglutination reaction; drop one drop of saline on the clean
slide; mix the to-be-tested culture into the saline drops; so that it becomes uniform
black background (if necessary, use magnifier to observe); if there is visible O
agglutination, then it is considered to have self-agglutination; otherwise it is considered
to have no self-agglutination. The culture without self-agglutination shall take the
serological identification as per the following method.
5.5.2 Identification of polyvalent bacterial antigen (O)
Draw 2 zones with size of 1cm×2cm; pick up 1-ring of to-be-tested bacteria; separately
place 1/2-ring on the upper part of each zone on the slide; thereof, the lower part of
one zone is added 1 drop of polyvalent bacterial (O) antiserum; the lower part of the
other zone is added 1 drop of saline to control. Then use sterile inoculation ring or
to shake and mix for 1min; observe against the black background; any degree of
agglutination was positive reaction. When O serum is not agglutinated, inoculate the
strains onto the medium with higher agar content (e.g. 2%~3%) to re-check; if the O
agglutination reaction is prevented due to the presence of Vi antigen, pick up bacteria
moss to make concentrated bacteria liquid in 1mL of saline; boiling on the alcohol lamp
flame then check.
5.5.3 Identification of polyvalent flagellum antigen (H)
The operation is the same as 5.5.2. When H antigen was poorly developed, inoculate
the strain into the center of 0.55%~0.65% semi-solid agar plate; when colonies were
glass tube containing 0.3%~0.4% semi-solid agar for once or twice, take bacteria from
the far end, culture and then check.
5.6 Serological classification (optional)
5.6.1 Identification of O antigen
Use A~F polyvalent O serum to do the slide agglutination test; meanwhile use saline
to control. The self-agglutination substances in the saline is rough strain, which can’t
be classified.
The substance that is agglutinated by A~F polyvalent O serum shall successively use
O4; O3, O10; O7; O8; O9; O2 and O11 factor serum to do the agglutination test. Judge
O10 serum shall use O10, O15, O34, O19 single factor serum to do the agglutination
test; judge the subgroups of E1, E4; the final determination of each O antigen
composition shall be based on the test results of O single factor serum; If there is no
O single factor serum, use two O complex factor serum to check.
H polyvalent 3 k, r, y, z, z10, lv, lw, lz13, lz28, lz40
H polyvalent 4, 1, 2; 1, 5; 1, 6; 1, 7; z6
H polyvalent 5 z4z23, z4z24, z4z32, z29, z35, z36, z38
H polyvalent 6 z39, z41, z42, z44
H polyvalent 7 z52, z53, z54, z55
The final determination of each H antigen composition shall be based on the test
results of H single factor serum; if there is no H single factor serum, then use two H
complex factor serum to verify.
When detecting H antigen in Phase-1 and failing to detect H antigen in Phase-2, or
when detecting H antigen in Phase-2 and failing to detect H antigen in Phase-1, 1
generation ~ 2 generations can be inoculated on the agar slope then check. If there is
still one-phase H antigen is found out, then use phase variation method to check
another phase. Single-phase bacteria don’t have to do phase variation test.
The phase variation test method is as follows.
plate; pick up 1-ring of factor serum to drop onto the semi-solid plate surface; stand for
a moment; when serum is absorbed into agar, dibble the to-be-tested strains in the
center of serum; after culturing, take bacteria from the edge of growing bacteria moss
to test.
Small glass tube method. melt the semi-solid tube (each tube about 1mL~2mL) onto
the alcohol lamp; and cool off to 50°C; take 0.05mL ~ 0.1mL of known phase H factor
serum, add it into the molten semi-solid substance; after mixing evenly; use capillary
pipette to absorb and place into small glass tube for phase variation test; after
coagulating, use inoculation needle to pick up to-be-tested bacteria; inoculate onto one
that prevent the moisture is vaporized and dry shrink; check the result every day; after
the other phase bacteria dissociation, the bacteria can be picked up from the other end
to check. The concentration of serum in the medium shall have appropriate proportion,
when it is too high, the bacteria can’t grow; when it is too low, the same phase bacteria
power can’t be suppressed. Generally, it is added with serum amount of 1.200~1.800.
Small inverted tube method. place the small glass tube (the lower-end opening shall
remain a gap rather than flush) with two ends open into the semi-solid tube; the upper
end of small glass tube shall be higher than the medium surface; backup after
sterilization. Heating and melting on the temporarily-used alcohol lamp; cool off to 50°C;
Appendix A
Medium and Reagent
A.1 Buffer Peptone Water (BPW)
A.1.1 Compositions
Peptone 10.0g
Sodium chloride 5.0g
Disodium hydrogen phosphate (containing 12 crystal water) 9.0g
Potassium dihydrogen phosphate ...
   
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