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GB 4789.40-2016

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标准详细信息 GB 4789.40-2016; GB4789.40-2016
中文名称: 食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验
英文名称: National food safety standard Food microbiological examination: Food microbiological examination: Enterobacter sakazakii
行业: 国家标准
中标分类: X09
发布日期: 2016-12-23
实施日期: 2017-06-23
旧标准 (被替代): GB 4789.40-2010; SN/T 1632.1-2013
标准依据: National Health and Family Planning Commission Notice No.17 of 2016

GB 4789.40-2016
National Food Safety Standard -- Food Microbiological Examination -- Examination of Cronobacter (Enterobacter Sakazakii)
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验
克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局 发 布
前言
本标准代替 GB 4789.40-2010《食品安全国家标准 食品微生物学检验 阪崎肠杆菌检验》、
SN/T 1632.1-2013《出口奶粉中阪崎肠杆菌(克罗诺杆菌属)检验方法 第1部分:分离与计数》。
本标准与GB 4789.40-2010相比,主要变化如下:
---标准名称修改为“食品安全国家标准 食品微生物学检验 克罗诺杆菌属(阪崎肠杆
菌)检验”;
---修改了可疑菌落的挑取数量。
食品安全国家标准
食品微生物学检验
克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验
1 范围
本标准规定了食品中克罗诺杆菌属(Cronobacter)的检验方法。
本标准适用于婴幼儿配方食品、乳和乳制品及其原料中克罗诺杆菌属的检验。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2.1 恒温培养箱:25℃±1℃,36℃±1℃,44℃±0.5℃。
2.2 冰箱:2℃~5℃。
2.3 恒温水浴箱:44℃±0.5℃。
2.4 天平:感量0.1g。
2.5 均质器。
2.6 振荡器。
2.7 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。
2.8 无菌锥形瓶:容量100mL、200mL、2000mL。
2.9 无菌培养皿:直径90mm。
2.10 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
2.11 全自动微生物生化鉴定系统。
3 培养基和试剂
3.1 缓冲蛋白胨水(bufferpeptonewater,BPW):见A.1。
3.2 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycin
medium,mLST-Vm):见A.2。
3.3 阪崎肠杆菌显色培养基。
3.4 胰蛋白胨大豆琼脂(trypticasesoyagar,TSA):见A.3。
3.5 生化鉴定试剂盒。
3.6 氧化酶试剂:见A.4。
3.7 L-赖氨酸脱羧酶培养基:见A.5。
3.8 L-鸟氨酸脱羧酶培养基:见A.6。
3.9 L-精氨酸双水解酶培养基:见A.7。
3.10 糖类发酵培养基:见A.8。
3.11 西蒙氏柠檬酸盐培养基:见A.9。
第一法 克罗诺杆菌属定性检验
4 检验程序
克罗诺杆菌属检验程序见图1。
图1 克罗诺杆菌属检验程序
5 操作步骤
5.1 前增菌和增菌
取检样100g(mL)置灭菌锥形瓶中,加入900mL已预热至44℃的缓冲蛋白胨水,用手缓缓地摇
动至充分溶解,36℃±1℃培养18h±2h。移取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤,44℃±0.5℃
培养24h±2h。
5.2 分离
5.2.1 轻轻混匀mLST-Vm肉汤培养物,各取增菌培养物1环,分别划线接种于两个阪崎肠杆菌显色
培养基平板,显色培养基须符合GB 4789.28的要求,36℃±1℃培养24h±2h,或按培养基要求条件
培养。
5.2.2 挑取至少5个可疑菌落,不足5个时挑取全部可疑菌落,划线接种于TSA平板。25℃±1℃培
养48h±4h。
5.3 鉴定
自TSA平板上直接挑取黄色可疑菌落,进行生化鉴定。克罗诺杆菌属的主要生化特征见表1。可
选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。
表1 克罗诺杆菌属的主要生化特征
生化试验 特 征
黄色素产生 +
氧化酶 -
L-赖氨酸脱羧酶 -
L-鸟氨酸脱羧酶 (+)
L-精氨酸双水解酶 +
柠檬酸水解 (+)
发酵
D-山梨醇
L-鼠李糖
D-蔗糖
D-蜜二糖
(-)
注:+>99%阳性;->99%阴性;(+)90%~99%阳性;(-)90%~99%阴性。
6 结果与报告
综合菌落形态和生化特征,报告每100g(mL)样品中检出或未检出克罗诺杆菌属。
第二法 克罗诺杆菌属的计数
7 操作步骤
7.1 样品的稀释
7.1.1 固体和半固体样品:无菌称取样品100g、10g、1g各三份,分别加入900mL、90mL、9mL已预
热至44℃的BPW,轻轻振摇使充分溶解,制成1∶10样品匀液,置36℃±1℃培养18h±2h。分别移
7.1.2 液体样品:以无菌吸管分别取样品100mL、10mL、1mL各三份,分别加入900mL、90mL、
9mL已预热至44℃的BPW,轻轻振摇使充分混匀,制成1∶10样品匀液,置36℃±1℃培养18h±
2h。分别移取1mL转种于10mLmLST-Vm肉汤,44℃±0.5℃培养24h±2h。
7.2 分离、鉴定
同5.2和5.3。
8 结果与报告
综合菌落形态、生化特征,根据证实为克罗诺杆菌属的阳性管数,查 MPN检索表,报告每100g
(mL)样品中克罗诺杆菌属的 MPN值(见表B.1)。
附 录 A
A.1 缓冲蛋白胨水(BPW)
A.1.1 成分
蛋白胨 10.0g
氯化钠 5.0g
磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 9.0g
磷酸二氢钾 1.5g
蒸馏水 1000mL
A.1.2 制法
加热搅拌至溶解,调节pH至7.2±0.2,121℃高压灭菌15min。
A.2.1 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨(mLST)肉汤
A.2.1.1 成分
氯化钠 34.0g
胰蛋白胨 20.0g
乳糖 5.0g
磷酸二氢钾 2.75g
磷酸氢二钾 2.75g
十二烷基硫酸钠 0.1g
蒸馏水 1000mL
加热搅拌至溶解,调节pH至6.8±0.2。分装每管10mL,121℃高压灭菌15min。
A.2.2 万古霉素溶液
A.2.2.1 成分
万古霉素 10.0mg
蒸馏水 10.0mL
A.2.2.2 制法
10.0mg万古霉素溶解于10.0mL蒸馏水,过滤除菌。万古霉素溶液可以在0℃~5℃保存15d。
A.2.3 改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素(Modifiedlaurylsulfatetryptosebroth-vancomycin
medium,mLST-Vm)
注:mLST-Vm必须在24h之内使用。
A.3 胰蛋白胨大豆琼脂(TSA)
A.3.1 成分
胰蛋白胨 15.0g
植物蛋白胨 5.0g
氯化钠 5.0g
琼脂 15.0g
蒸馏水 1000mL
A.3.2 制法
A.4 氧化酶试剂
A.4.1 成分
N,N,N',N'-四甲基对苯二胺盐酸盐 1.0g
蒸馏水 100mL
A.4.2 制法
少量新鲜配制,于冰箱内避光保存,在7d之内使用。
A.4.3 试验方法
用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落,涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。如果滤纸
在10s中之内未变为紫红色、紫色或深蓝色,则为氧化酶试验阴性,否则即为氧化酶实验阳性。
A.5 L-赖氨酸脱羧酶培养基
A.5.1 成分
L-赖氨酸盐酸盐(L-lysinemonohydrochloride) 5.0g
酵母浸膏 3.0g
葡萄糖 1.0g
溴甲酚紫 0.015g
蒸馏水 1000mL
A.5.2 制法
将各成分加热溶解,必要时调节pH至6.8±0.2。每管分装5mL,121℃高压15min。
挑取培养物接种于L-赖氨酸脱羧酶培养基,刚好在液体培养基的液面下。30℃±1℃培养24h±
2h,观察结果。L-赖氨酸脱羧酶试验阳性者,培养基呈紫色,阴性者为黄色,空白对照管为紫色。
A.6 L-鸟氨酸脱羧酶培养基
A.6.1 成分
L-鸟氨酸盐酸盐(L-ornithinemonohydrochloride) 5.0g
酵母浸膏 3.0g
葡萄糖 1.0g
溴甲酚紫 0.015g
蒸馏水 1000mL
将各成分加热溶解,必要时调节pH至6.8±0.2。每管分装5mL。121℃高压15min。
A.6.3 实验方法
挑取培养物接种于L-鸟氨酸脱羧酶培养基,刚好在液体培养基的液面下。30℃±1℃培养24h±
2h,观察结果。L-鸟氨酸脱羧酶试验阳性者,培养基呈紫色,阴性者为黄色。
A.7 L-精氨酸双水解酶培养基
A.7.1 成分
L-精氨酸盐酸盐(L-argininemonohydrochloride) 5.0g
酵母浸膏 3.0g
葡萄糖 1.0g
蒸馏水 1000mL
A.7.2 制法
将各成分加热溶解,必要时调节pH至6.8±0.2。每管分装5mL。121℃高压15min。
A.7.3 实验方法
挑取培养物接种于L-精氨酸脱羧酶培养基,刚好在液体培养基的液面下。30℃±1℃培养24h±
2h,观察结果。L-精氨酸脱羧酶试验阳性者,培养基呈紫色,阴性者为黄色。
A.8 糖类发酵培养基
A.8.1 基础培养基
A.8.1.1 成分
氯化钠 5.0g
酚红 0.02g
蒸馏水 1000mL
A.8.1.2 制法
将各成分加热溶解,必要时调节pH至6.8±0.2。每管分装5mL。121℃高压15min。
A.8.2 糖类溶液(D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙)
A.8.2.1 成分
糖 8.0g
蒸馏水 100mL
分别称取D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙等糖类成分各8g,溶于100mL蒸馏水
中,过滤除菌,制成80mg/mL的糖类溶液。
A.8.3 完全培养基
A.8.3.1 成分
基础培养基 875mL
糖类溶液 125mL
A.8.3.2 制法
无菌操作,将每种糖类溶液加入基础培养基,混匀;分装到无菌试管中,每管10mL。
A.8.4 实验方法
2h,观察结果。糖类发酵试验阳性者,培养基呈黄色,阴性者为红色。
A.9 西蒙氏柠檬酸盐培养基
A.9.1 成分
柠檬酸钠 2.0g
氯化钠 5.0g
磷酸氢二钾 1.0g
磷酸二氢铵 1.0g
硫酸镁 0.2g
溴麝香草酚蓝 0.08g
蒸馏水 1000mL
A.9.2 制法
将各成分加热溶解,必要时调节pH至6.8±0.2。每管分装10mL,121℃高压15min,制成斜面。
A.9.3 实验方法
挑取培养物接种于整个培养基斜面,36℃±1℃培养24h±2h,观察结果。阳性者培养基变为
蓝色。
附 录 B
克罗诺杆菌属最可能数(MPN)检索表
每100g(mL)检样中克罗诺杆菌属最可能数(MPN)的检索见表B.1。
阳性管数
MPN
95%可信限
下限 上限
阳性管数
MPN
95%可信限
下限 上限
0 0 0 <0.3 - 0.95 2 2 0 2.1 0.45 4.2
0 1 0 0.3 0.015 1.1 2 2 2 3.5 0.87 9.4
0 1 1 0.61 0.12 1.8 2 3 0 2.9 0.87 9.4
0 2 0 0.62 0.12 1.8 2 3 1 3.6 0.87 9.4
0 3 0 0.94 0.36 3.8 3 0 0 2.3 0.46 9.4
1 0 0 0.36 0.017 1.8 3 0 1 3.8 0.87 11
1 0 1 0.72 0.13 1.8 3 0 2 6.4 1.7 18
1 0 2 1.1 0.36 3.8 3 1 0 4.3 0.9 18
1 1 0 0.74 0.13 2 3 1 1 7.5 1.7 20
1 1 1 1.1 0.36 3.8 3 1 2 12 3.7 42
1 2 1 1.5 0.45 4.2 3 2 0 9.3 1.8 42
1 3 0 1.6 0.45 4.2 3 2 1 15 3.7 42
2 0 0 0.92 0.14 3.8 3 2 2 21 4 43
2 0 1 1.4 0.36 4.2 3 2 3 29 9 100
2 0 2 2 0.45 4.2 3 3 0 24 4.2 100
2 1 0 1.5 0.37 4.2 3 3 1 46 9 200
2 1 1 2 0.45 4.2 3 3 2 110 18 410
2 1 2 2.7 0.87 9.4 3 3 3 >110 42 -
注1:本表采用3个检样量[100g(mL)、10g(mL)和1g(mL)],每个检样量接种3管。
(mL)、1g(mL)和0.1g(mL)时,则表内数字应相应增高10倍,其余类推。


GB 4789.40-2016
GB
NATIONAL STANDARD OF
THE PEOPLE’S REPUBLIC OF CHINA
National Food Safety Standard –
Food Microbiological Examination –
Examination of Cronobacter (Enterobacter Sakazakii)
食品安全国家标准 食品微生物学检验
克罗诺杆菌属(阪崎肠杆菌)检验
ISSUED ON. DECEMBER 23, 2016
IMPLEMENTED ON. JUNE 23, 2017
Issued by. National Health and Family Planning Commission of the
People 's Republic of China;
China Food and Drug Administration.
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Table of Contents
Foreword ... 3 
1 Scope ... 4 
2 Equipment and materials ... 4 
3 Medium and reagent ... 5 
Method One Qualitative test of Cronobacter ... 5 
4 Examination procedures ... 5 
5 Operation steps ... 6 
6 Result and report ... 7 
7 Operation steps ... 8 
8 Result and report ... 8 
Annex A Medium and reagent ... 9 
Annex B The most probable number (MPN) search table for Cronobacter ... 14 
Foreword
This Standard replaces GB 4789.40-2010 National food safety standard Food
microbiological examination. Enterobacter sakazakii, SN/T 1632.1-2013
Detection of enterobacter sakazakii from dehydrated powdered milk for
export - Part 1. Isolation and enumeration.
Compared with GB 4789.40-2010, the main changes in this Standard are as
follows.
- modified the standard’s name to “National Food Safety Standard - Food
Microbiological Examination - Examination of Cronobacter
(Enterobacter Sakazakii)”;
- modified the number of suspicious colonies picked.
National Food Safety Standard –
Food Microbiological Examination –
Examination of Cronobacter (Enterobacter Sakazakii)
1 Scope
This Standard specifies the examination method for Cronobacter in food.
This Standard applies to the examination of Cronobacter in infant formula,
milk and dairy products and their raw materials.
2 Equipment and materials
In addition to microbial laboratory routine sterilization and training equipment,
other equipment and materials are as follows.
2.1 Thermostat incubator. 25°C ± 1°C, 36°C ± 1°C, 44°C ± 0.5°C
2.2 Refrigerator. 2°C ~ 5°C
2.3 Constant temperature water bath. 44°C ± 0.5°C
2.4 Balance. resolution of 0.1 g
2.5 Homogenizer
2.6 Oscillator
2.7 Sterile pipettes. 1 mL (with 0.01 mL scale), 10 mL (with 0.1 mL scale) or
micro pipette and suction head
2.8 Sterile conical flask. capacity of 100 mL, 200 mL, 2000 mL
2.9 Sterile Petri dish. 90 m in diameter
2.10 pH meter or pH colorimetric tube or precision pH test paper
2.11 Automatic microbial biochemical identification system
3 Medium and reagent
3.1 Buffer peptone water. see A.1
3.2 Modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin medium, mLST-Vm).
see A.2
3.3 Enterobacter sakazakii chromogenic medium
3.4 Trypticase soy agar, TSA. see A.3
3.6 Oxidase reagent. see A.4
3.7 L-lysine decarboxylase medium. see A.5
3.8 L-ornithine decarboxylase medium. see A.6
3.9 L-arginine bishydrolase medium. see A.7
3.10 Carbohydrate fermentation medium. see A.8
3.11 Citrus citrate medium. see A.9
Method One Qualitative test of Cronobacter
4 Examination procedures
See Figure a for the examination procedures of Cronobacter.
7.1 Sample dilution
7.1.1 Solid and semi-solid samples. sterilely weigh 100 g, 10 g, 1g of
samples, respectively add into 900 mL, 90 mL, 9 mL of BPW that have been
preheated to 44°C. Gently shake to fully dissolved, make 1.10 sample
homogenizing solution, culture at 36°C ± 1°C for 18h ± 2h. Respectively
transfer 1 mL to inoculate in 10 mL LmST-Vm broth, culture at 44°C ± 0.5°C
for 24h ± 2h.
7.1.2 Liquid sample. use a sterile pipette to take 100 mL, 10 mL, 1 mL of
samples, respectively add into 900 mL, 90 mL, 9 mL of BPW that have been
homogenizing solution, culture at 36°C ± 1°C for 18h ± 2h. Respectively
transfer 1 mL to inoculate in 10 mL LmST-Vm broth, culture at 44°C ± 0.5°C
for 24h ± 2h.
7.2 Separation, identification
Same with 5.2 and 5.3.
8 Result and report
Combining the colony morphology, biochemical characteristics and according
to the confirmed number of positive tubes of Cronobacter, check MPN search
table and report the MPN value of Cronobacter per 100 g (mL) of sample (see
sterilization. The vancomycin solution can be stored at 0°C ~ 5°C for 15 d.
A.2.3 Modified lauryl sulfate tryptose broth - vancomycin medium,
mLST-Vm
Add 0.1 mL of vancomycin solution into per 10 mL of mLST. The final
concentration of vancomycin in the mixture is 10 μg/mL.
NOTE. mLST-Vm must be used within 24h.
A.3 Tryptone soy agar (T S A)
A.3.1 Composition
Tryptone 15.0 g
Sodium chloride 5.0 g
Agar 15.0 g
Distilled water 1000 mL
A.3.2 Preparation method
Heating and stirring to dissolved. Boiling for 1 min. Adjust pH to 7.3 ± 0.2.
Autoclave at 121°C for 15 min.
A.4 Oxidase reagent
A.4.1 Composition
N, N, N ', N' - tetramethylphenylene diamine hydrochloride 1.0 g
A.4.2 Preparation method
Make a small amount of fresh preparation. Store in the refrigerator from light.
Use within 7d.
A.4.3 Test method
Use a glass rod or a disposable inoculation needle to pick up a single
characteristic colony and coat it on a filter paper plate moistened with an
oxidase reagent. If the filter paper does not become magenta, purple or dark
blue within 10s, the oxidase test is negative, otherwise the oxidase test is
positive.
A.5 L-lysine decarboxylase medium
A.5.1 Composition
A.7.2 Preparation method
Heat and dissolve the components, and if necessary, adjust pH to 6.8 ± 0.2.
Sub-packaging 5 mL for each tube. Autoclave at 121°C for 15 min.
A.7.3 Experimental method
Inoculate the culture into the L-arginine decarboxylase medium, just under
the liquid level of the liquid medium. Culture at 30°C ± 1°C for 24h ± 2h.
Observe the results. L-arginine decarboxylase test is positive; the medium is
A.8 Carbohydrate fermentation medium
A.8.1 Basal medium
A.8.1.1 Composition
Casein (enzyme digestion) 10.0 g
Sodium chloride 5.0 g
Phenol red 0.02 g
Distilled water 1000 mL
A.8.1.2 Preparation method
Heat and dissolve the components, and if necessary, adjust pH to 6.8 ± 0.2.
A.8.2 Sugar solution (D-sorbitol, L-rhamnose, D-sucrose, D-melibiose,
amygdalin)
A.8.2.1 Composition
Sugar 8.0 g
Distilled water 100 mL
A.8.2.2 Preparation method
Respectively weigh 8 g of D-sorbitol, L-rhamnose, D-sucrose, D-honey
disaccharide, amygdalin and dissolve into 100 mL of distilled water. Filter for
sterilization, make 80 mg/mL sugar solution.
A.8.3.1 Composition
Basal medium 875 mL
Sugar solution 125 mL
A.8.3.2 Preparation method
Aseptically add each saccharide solution to the basal medium and mix well.
   
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