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GB 4789.41-2016

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标准详细信息 GB 4789.41-2016; GB4789.41-2016
中文名称: 食品安全国家标准 食品微生物学检验 肠杆菌科检验
英文名称: (Food safety national standard - Food microbiology - Examination of Enterobacteriaceae)
行业: 国家标准
字数估计: 14,000
发布日期: 2016-08-31
实施日期: 2017-03-01
标准依据: 国家卫生和计划生育委员会公告2016年第11号

GB 4789.41-2016
(Food safety national standard - Food microbiology - Examination of Enterobacteriaceae)
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验 肠杆菌科检验
2016-08-31发布
2017-03-01实施
中 华 人 民 共 和 国
国家卫生和计划生育委员会 发 布
食品安全国家标准
食品微生物学检验 肠杆菌科检验
1 范围
本标准第一法适用于肠杆菌科含量较高的食品中肠杆菌科的计数;第二法适用于肠杆菌科含量较
低食品中肠杆菌科的计数。
2 术语和定义
2.1
肠杆菌科 Enterobacteriaceae
在给定条件下发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性的需氧或兼性厌氧革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2.2
肠杆菌科计数 EnumerationofEnterobacteriaceae
按本标准规定方法,对每克或每毫升检样中的肠杆菌科进行计数。
2.3
最可能数 mostprobablenumber;MPN
基于泊松分布的一种间接计数方法。
3 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
3.1 恒温培养箱:36℃±1℃。
3.2 冰箱:2℃~5℃。
3.3 水浴箱:46℃±1℃。
3.4 天平:感量0.1g。
3.5 显微镜:10倍~100倍。
3.6 均质器。
3.7 振荡器。
3.8 无菌吸管:1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸头。
3.9 无菌锥形瓶或等效容器:容量150mL、500mL。
3.10 无菌培养皿:直径90mm。
3.11 无菌试管:18mm×180mm、15mm×150mm。
3.12 pH计或pH比色管或精密pH试纸。
4 培养基和试剂
4.1 缓冲蛋白胨水(BPW):见B.1。
4.2 缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤(EE肉汤):见B.2。
4.3 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA):见B.3。
4.4 营养琼脂(NA):见B.4。
4.5 葡萄糖琼脂:见B.5。
4.6 革兰氏染色液:见B.6。
4.7 氧化酶试剂:见B.7。
4.8 无菌1mol/LNaOH:见B.8。
4.9 无菌1mol/LHCl:见B.9。
第一法 肠杆菌科平板计数法
5 检验程序
肠杆菌科平板计数法检验程序见图1。
图1 肠杆菌科平板计数法检验程序
6 操作步骤
6.1 样品的稀释
6.1.1 固体和半固体样品:称取25g样品放入盛有225mLBPW 的无菌均质杯中,8000r/min~
10000r/min均质1min~2min,或放入盛有225mLBPW 的无菌均质袋中,用拍击式均质器拍打
1min~2min,制成1∶10的样品匀液。
6.1.2 液体样品:以无菌吸管吸取25mL样品放入盛有225mLBPW的无菌锥形瓶(瓶内预置适当数
量的无菌玻璃珠)中,充分混匀,制成1∶10的样品匀液。
6.1.3 用1mL无菌吸管或微量移液器吸取1∶10样品匀液1mL,沿管壁缓缓注入盛有9mLBPW的
无菌试管中(注意吸管或吸头尖端不应触及稀释液面),振摇试管或换用1支1mL无菌吸管反复吹打,
使其混合均匀,制成1∶100的样品匀液。
6.1.4 按6.1.3操作程序,依次制成10倍递增系列稀释样品匀液。每递增稀释1次,换用1支1mL无
菌吸管或吸头。从制备样品匀液至样品接种完毕,全过程不得超过15min。
6.2 倾注平板和培养
6.2.1 根据对样品污染状况的估计及相关限量要求,选择2个~3个适宜的连续稀释度的样品匀液(液
体样品可以选择原液),每个稀释度接种2个无菌平皿。同时,分别吸取1mLBPW 加入两个无菌平皿
内作为空白对照。
6.2.2 将10mL~15mL冷却至46℃的VRBGA(可放置于46℃±1℃恒温水浴箱中保温)倾注于每
个平皿中。小心旋转平皿,使样品匀液与培养基充分混匀。
6.2.3 待琼脂凝固后,倾注一薄层同样的培养基覆盖平板表层。防止蔓延生长并使菌落特征更为
明显。
6.2.4 待VRBGA平板上层琼脂凝固后翻转平板,36℃±1℃培养18h~24h。
6.3 典型菌落计数和确认
6.3.1 肠杆菌科典型菌落为有或无沉淀环的粉红色至红色或紫色菌落。选取典型菌落数在15CFU~
150CFU之间、无蔓延菌落生长的平板,只计数典型菌落数。菌落计数以菌落形成单位(colony-
formingunits,CFU)表示。
6.3.2 其中一个平板有较大片状菌落生长时,则不宜采用,而应以无片状菌落生长的平板作为该稀释
度的菌落数;若片状菌落不到平板的一半,而其余一半中菌落分布又很均匀,即可计算半个平板后乘以
2,代表一个平板菌落数。
6.3.4 从每个平板上至少挑取5个(小于5个全选)典型菌落进行确认;如果有不同形态的典型菌落,则
每种形态分别至少挑取1个菌落进行确认。
6.3.5 典型菌落的确认:
a) 分别将所挑选的每一个菌落,划线于营养琼脂平板,36℃±1℃培养18h~24h,挑取平板上
的菌落进行革兰氏染色镜检、氧化酶试验及葡萄糖发酵试验。
b) 革兰氏染色镜检:肠杆菌科为革兰氏阴性杆菌,无芽孢,大小为(0.3~1.0)μm×(1.0~
6.0)μm。
c) 氧化酶试验:用铂/铱接种环或玻璃棒(不要用镍铬接种环)挑取单个菌落涂于浸湿氧化酶试剂
的滤纸上,滤纸的颜色在10s内变成蓝紫色,判为阳性反应。
1℃培养24h±2h,若试管内的内容物变为黄色,判为阳性反应。
6.4 结果的计算
6.4.1 一般原则
若有两个连续稀释度的平板典型菌落数在适宜计数范围内,按式(1)计算,示例见 A.1、A.2、
A.3、A.4。
N= ∑
(n1+0.1n2)d
(1)
式中:
∑a---确证的肠杆菌科菌落数之和;
n1 ---第一稀释度(低稀释倍数)平板个数(含确证的肠杆菌科菌落);
n2 ---第二稀释度(高稀释倍数)平板个数(含确证的肠杆菌科菌落);
d ---稀释因子(第一稀释度)。
其中,a按式(2)计算:
a=
A ×C
(2)
式中:
b---某一平板中A 个菌落中被确证为肠杆菌科的菌落数,b≤A;
A---某一平板中用于确认试验的菌落数;
C---某一平板中典型菌落总数。
6.4.2 低菌落数
若最低稀释度(包括液体样品原液)平板的典型菌落数均小于15CFU,具有确证的肠杆菌科菌落,
则以确证的菌落数乘以最低稀释倍数计算。
若最低稀释度(包括液体样品原液)平板均无菌落生长,或典型菌落数均小于15CFU,且无确证的
肠杆菌科菌落,则以小于1乘以最低稀释倍数计算。
6.4.3 特殊情况
板上无确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不在15CFU~150CFU之间,则以确证的菌落数乘以第一
稀释倍数计算,示例见A.5。
若所有稀释度的平板上典型菌落数均不在适宜计数范围内,且无确证的肠杆菌科菌落,则以小于1
乘以最低稀释倍数计算。
7 报告
7.1 菌落数小于100时,以整数报告。
7.2 菌落数大于或等于100时,对第3位数字进行修约后,取前2位数字,后面用0代替位数;也可用
10的指数形式来表示,采用两位有效数字。
7.3 数字修约按“四舍五入”原则进行。
7.5 若空白对照上有菌落生长,则此次检测结果无效。
7.6 称重取样以CFU/g为单位报告,体积取样以CFU/mL为单位报告。
第二法 肠杆菌科 MPN计数法
8 检验程序
肠杆菌科 MPN计数法检验程序见图2。
图2 肠杆菌科 MPN计数法检验程序
9 操作步骤
9.1 样品的稀释
按6.1进行。
9.2.1 非选择性前增菌
根据对样品污染状况的估计及相关限量要求,选择3个适宜连续稀释度的样品匀液,每个稀释度
3管,共9管BPW于36℃ ±1℃培养18h±2h。
9.2.2 选择性增菌
从BPW各培养管中,分别移取1mL培养物,接种于10mL的EE肉汤中,36℃±1℃培养24h±
2h。
9.2.3 分离
用接种环从EE各肉汤管中分别取培养物1环,划线接种于VRBGA平板,36℃±1℃培养24h±
2h,观察平板上有无典型菌落。
典型菌落确认见6.3。
10 报告
肠杆菌科为革兰氏阴性无芽胞杆菌,发酵葡萄糖产酸、氧化酶阴性。只要有1个菌落确认为肠杆菌
科,其所代表的EE管即为肠杆菌科阳性,依据EE阳性管数查 MPN表(见附录C),报告每克(毫升)样
品中肠杆菌科的 MPN值。称重取样以 MPN/g为单位报告,体积取样以 MPN/mL为单位报告。
附 录 A
结果计算示例
A.1 两个连续稀释度均含适宜的典型菌落数平板,并含有已确证的肠杆菌科菌落,数据见表A.1。
表A.1 肠杆菌科平板计数结果示例1
典型菌落数/CFU 126 145 20 24
用于确认试验的菌落数/CFU 5 5 5 5
确证的菌落数/CFU 4 5 4 3
a 4/5×126=101 5/5×145=145 4/5×20=16 3/5×24=14
N=
101+145+16+14
[2+(0.1×2)]×10-2
0.022=12545
上述数据按7.2数字修约后,表示为13000或1.3×104。
或者两个稀释度各有一个平板菌落数不在适宜范围内,则相应的平板不作为计数平板,数据见表A.2。
表A.2 肠杆菌科平板计数结果示例2
稀释度 1∶100(第一稀释度) 1∶1000(第二稀释度)
典型菌落数/CFU 126 118 20 10
用于确认试验的菌落数/CFU 5 8 5 -
确证的菌落数/CFU 4 5 4 -
a 4/5×126=101 5/8×118=74 4/5×20=16 -
N=
101+74+16
0.021=9095
上述数据按7.2数字修约后,表示为9100或9.1×103。
A.3 两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板,其中一个平板无已确证的肠杆菌科菌落,则相应的平
板不作为计数平板,数据见表A.3。
表A.3 肠杆菌科平板计数结果示例3
稀释度 1∶100(第一稀释度) 1∶1000(第二稀释度)
典型菌落数/CFU 126 118 20 20
用于确认试验的菌落数/CFU 5 6 5 5
确证的菌落数/CFU 4 6 4 0
N=
101+118+16+0
[2+(0.1×1)]×10-2
0.021=11190
上述数据按7.2数字修约后,表示为11000或1.1×104。
A.4 两个连续稀释度均含适宜典型菌落数平板,但无已确证的肠杆菌科菌落,则以小于1乘以最低稀
释倍数计算。
A.5 第一稀释度平板上的菌落数超过150CFU,且有证实的肠杆菌科菌落,以及第二稀释度平板上无
确证的肠杆菌科菌落或典型菌落数不在15CFU~150CFU之间,则以确证的菌落数乘以第一稀释倍
表A.5 肠杆菌科平板计数结果示例5
稀释度 1∶100(第一稀释度) 1∶1000(第二稀释度)
典型菌落数/CFU 220 198 23 17
用于确认试验的菌落数/CFU 5 5 5 5
确证的菌落数/CFU 4 3 0 0
a 4/5×220=176 3/5×198=119 0 0
N= 176+1192
÷×102=14750
附 录 B
B.1 缓冲蛋白胨水(BPW)
B.1.1 成分
蛋白胨 10.0g
氯化钠 5.0g
磷酸氢二钠 3.5g
磷酸二氢钾 1.5g
蒸馏水 1000.0mL
B.1.2 制法
将B.1.1成分加热溶解,于25℃时调节pH至7.2±0.2,分装于500mL广口瓶中,每瓶225mL,
B.2 缓冲葡萄糖煌绿胆盐肉汤(EE肉汤)
B.2.1 成分
蛋白胨 10.0g
葡萄糖 5.0g
磷酸氢二钠(无水) 6.45g
磷酸二氢钾 2.0g
牛胆盐 20.0g
煌绿 0.0135g
蒸馏水 1000.0mL
将B.2.1成分溶于水中,加热煮沸至完全溶解,加热不宜超过30min,迅速冷却培养基,于25℃调
节pH至7.2±0.2,分装于灭菌的18mm×180mm试管中,每管10mL,不需高压灭菌,5℃±3℃可存
放一个月。
B.3 结晶紫中性红胆盐葡萄糖琼脂(VRBGA)
B.3.1 成分
蛋白胨 7.0g
酵母浸膏 3.0g
3号胆盐 1.5g
葡萄糖 10.0g
中性红 0.03g(或0.6%酒精溶液5mL)
结晶紫 0.002g(或0.1%水溶液2mL)
琼脂粉 10.0g~12.0g
蒸馏水 1000.0mL
B.3.2 制法
将B.3.1成分溶于水中,加热煮沸至完全溶解,25℃时调节pH至7.4±0.2,分装于灭菌的锥形烧
瓶中,不需高压灭菌,用前制备。倾注平板,使用前干燥平板。未干燥的平板5℃±3℃可存放两周。
B.4 营养琼脂(NA)
B.4.1 成分
蛋白胨 5.0g
琼脂粉 10.0g~12.0g
蒸馏水 1000.0mL
B.4.2 制法
将B.4.1成分溶于水中,加热煮沸,25℃时调节pH至7.3±0.2,121℃高压灭菌15min。倾注平
板,使用前干燥平板。未干燥的平板于5℃±3℃可存放两周。
B.5 葡萄糖琼脂
B.5.1 成分
胰蛋白胨 10.0g
葡萄糖 10.0g
氯化钠 5.0g
溴甲酚紫 0.015g(或0.4%溴甲酚紫酒精溶液3.75mL)
琼脂粉 10.0g~12.0g
蒸馏水 1000.0mL
B.5.2 制法
将B.5.1成分溶于水中,加热煮沸,25℃时调节pH至7.0±0.2,分装于15mm×150mm试管,每
管约5mL,121℃高压灭菌15min后,试管垂直放置。于5℃±3℃可存放1周。为去除培养基中的
氧气,使用前可将葡萄糖琼脂试管置于沸水浴中15min,然后迅速冷却,备用。
B.6.1 结晶紫染色液
B.6.1.1 成分
结晶紫 1.0g
95%乙醇 20.0mL
1%草酸铵水溶液 80.0mL
B.6.1.2 制法
将结晶紫完全溶解于乙醇中,然后与草酸铵溶液混合。
B.6.2 革兰氏碘液
B.6.2.1 成分
碘化钾 2.0g
蒸馏水 300.0mL
B.6.2.2 制法
将碘和碘化钾先行混合,加入少许蒸馏水充分振摇,待完全溶解后,再加蒸馏水至300mL。
B.6.3 沙黄复染液
B.6.3.1 成分
沙黄 0.25g
95%乙醇 10.0mL
蒸馏水 90.0mL
将沙黄溶解于乙醇中,然后用蒸馏水稀释。
B.6.4 染色方法
B.6.4.1 将涂片在火焰上固定,滴加结晶紫染色液,染1min,水洗。
B.6.4.2 滴加革兰氏碘液,作用1min,水洗。
B.6.4.3 滴加95%乙醇脱色15s~30s,直至染色液被洗掉,但不要过分脱色、水洗。
B.6.4.4 加沙黄复染液,复染1min,水洗、干燥、镜检。
B.6.4.5 革兰氏阳性菌呈紫色,革兰氏阴性菌呈红色。
B.7 氧化酶试剂
B.7.1 成分
蒸馏水 100.0mL
B.7.2 制法
将B.7.1成分溶解于冷水中,少量新鲜配制。
B.7.3 试验方法
用细玻璃棒或一次性接种针挑去单个菌落,涂布在氧化酶试剂湿润的滤纸上。在10s内呈现粉红
或紫红色,即为氧化酶试验阳性。不变色者为氧化酶试验阴性。
B.8 无菌1mol/LNaOH
B.8.1 成分
NaOH 40.0g
B.8.2 制法
称取40g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15min。
B.9 无菌1mol/LHCl
B.9.1 成分
HCl 90.0mL
蒸馏水 1000.0mL
B.9.2 制法
移取浓盐酸90mL,用蒸馏水稀释至1000mL,121℃高压灭菌15min。
附 录 C
每克(毫升)检样中肠杆菌科最可能数(MPN)的检索见表C.1。
表C.1 肠杆菌科最可能数(MPN)的检索表
阳性管数
0.10 0.01 0.001
MPN
95%置信区间
下限 上限
阳性管数
0.10 0.01 0.001
95%置信区间
下限 上限
0 0 0 <3.0 - 9.5 2 2 0 21 4.5 42
0 0 1 3.0 0.15 9.6 2 2 1 28 8.7 94
0 1 0 3.0 0.15 11 2 2 2 35 8.7 94
0 1 1 6.1 1.2 18 2 3 0 29 8.7 94
0 2 0 6.2 1.2 18 2 3 1 36 8.7 94
0 3 0 9.4 3.6 38 3 0 0 23 4.6 94
1 0 0 3.6 0.17 18 3 0 1 38 8.7 110
1 0 2 11 3.6 38 3 1 0 43 9 180
1 1 0 7.4 1.3 20 3 1 1 75 17 200
1 1 1 11 3.6 38 3 1 2 120 37 420
1 2 0 11 3.6 42 3 1 3 160 40 420
1 2 1 15 4.5 42 3 2 0 93 18 420
1 3 0 16 4.5 42 3 2 1 150 37 420
2 0 0 9.2 1.4 38 3 2 2 210 40 430
2 0 1 14 3.6 42 3 2 3 290 90 1000
2 0 2 20 4.5 42 3 3 0 240 42 1000
2 1 1 20 4.5 42 3 3 2 1100 180 4100
2 1 2 27 8.7 94 3 3 3 >1100 420 -
注1:本表采用3个稀释度[0.1g(mL)、0.01g(mL)和0.001g(mL)],每个稀释度接种3管。
注2:表内所列检样量如改用1g(mL)、0.1g(mL)和0.01g(mL)时,表内数字应相应降低10倍;如改用0.01g
(mL)、0.001g(mL)、0.0001g(mL)时,则表内数字应相应增高10倍,其余类推。

GB 4789.41-2016
GB
NATIONAL STANDARD OF THE
PEOPLE’S REPUBLIC OF CHINA
National Food Safety Standard -
Microbiological Examination of Food Hygiene -
Examination of Enterobacteriaceae
食品卫生国家标准
食品微生物学检验 肠杆菌科检验
ISSUED ON. AUGUST 31, 2016
IMPLEMENTED ON. MARCH 1, 2017
Issued by. National Health and Family Planning Commission of the
People’s Republic of China
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Table of Contents
1 Application Scope ... 3 
2 Terms and Definitions ... 3 
3 Apparatus and Materials ... 3 
4 Culture Media and Reagents ... 4 
5 Test Procedures ... 5 
6 Operating Procedures ... 5 
7 Report ... 9 
8 Test Procedures ... 9 
9 Operating Procedures ... 11 
10 Report ... 11 
Annex A Examples for Calculation of Results ... 12 
Annex B Culture Media and Reagents ... 14 
Annex C Retrieval Table of Enterobacteriaceae Most Probable Numbers
(MPNs) ... 18 
National Food Safety Standard -
Microbiological Examination of Food Hygiene -
Examination of Enterobacteriaceae
1 Application Scope
This Standard specifies the method for the test of Enterobacteriaceae in foods.
The first method of this Standard applies to the bacterial counts of Enterobacteriaceae
in the foods which has a high content of Enterobacteriaceae; and the second method
applies to the bacterial counts of Enterobacteriaceae in the foods which has a low
content of Enterobacteriaceae.
2 Terms and Definitions
2.1
Enterobacteriaceae
The oxidase-negative aerobic or facultative anaerobic Gram-negative non-spore-
bearing bacillus, which ferments glucose producing acid under given conditions.
2.2
Enumeration of Enterobacteriaceae
The enumeration of Enterobacteriaceae per gram or per millimeter in accordance with
the method specified in this Standard.
2.3
most probable number; MPN
An indirect enumeration method based on Poisson's distribution.
3 Apparatus and Materials
In addition to the conventional sterilization and culture apparatus in the microbiological
laboratories, the other apparatus and materials are as follows.
3.1 Thermostatic incubator. 36°C ± 1°C.
3.2 Refrigerator. 2°C ~ 5°C.
3.3 Water bath. 46°C ± 1°C.
3.4 Balance. sensitivity 0.1 g.
3.5 Microscope. 10X ~ 100X.
3.6 Homogenizer.
3.7 Shaker.
3.8 Sterile pipettes. 1 ml (having graduates of 0.01 ml), 10 ml (having 0.1 ml) or
micropipettors and tips.
3.9 Sterile conical flasks or equivalent vessels. capacities 150 ml and 500 ml.
3.10 Sterile culture dishes. diameter 90 mm.
3.11 Sterile test tubes. 18 mm × 180 mm and 15 mm × 150 mm.
3.12 pH meters or pH colorimetric tubes or precise pH test paper.
4 Culture Media and Reagents
4.2 Buffered glucose brilliant green bile broth (EE broth). see B.2.
4.3 Crystal violet neutral red bile salt glucose agar (VRBGA). see B.3.
4.4 Nutrient agar (NA). see B.4.
4.5 Glucose agar. see B.5.
4.6 Gram stain solution. see B.6.
4.7 Oxidase reagent. see B.7.
4.8 Sterile 1 mol/l NaOH. see B.8.
4.9 Sterile 1 mol/l HCl. see B.9.
Method I The Enterobacteriaceae Plate Count
6.1.1 Solid and semi-solid specimens. take 25 g of specimen to place into a sterile
homogeneous cup containing 225 ml of BPW, homogenize for 1 min ~ 2 min at 8 000
r/min ~ 10 000 r/min, or place into a homogeneous bag containing 225 ml of BPW, use
a vibrating homogenizer to vibrate for 1 min ~ 2 min, and make homogeneous
specimen solutions of 1.10.
6.1.2 Liquid specimens. use a sterile pipette to absorb 25 ml of specimen to pour into
a sterile conical flask (in which an appropriate quantity of sterile glass beads are
provided in the flask in advance) containing 225 ml of BPW, mix up, and make
homogeneous specimen solutions of 1.10.
homogeneous solution of 1.10, pour slowly along the wall of the sterile test tube
containing 9 ml of BPW (attention is drawn to that the pipette or the tip shall not contact
with the diluent surface), vibrate the test tube or replace one 1-ml sterile pipette to blow
and beat repeatedly to mix up, and make homogeneous specimen solutions of 1.100.
6.1.4 In accordance with the operating procedures of 6.1.3, make tenfold increasing
serial diluted specimen homogeneous solutions. For each time of increasing dilution,
replace one 1-ml sterile pipette or tip. The whole process from the preparation of the
specimen homogeneous solutions to the completion of inoculation of specimens shall
not exceed 15 min.
6.2.1 In accordance with the estimation of the contamination of specimens and
relevant limit requirements, select 2 ~ 3 homogeneous specimen solutions (liquid
specimens may be raw solutions) of appropriate continuous dilution and inoculate the
solutions of each dilution degree to 2 sterile plates. And Meanwhile, absorb 1 ml of
BPW each to add to two sterile plates as blank control.
6.2.2 Pour 10 ml ~ 15 ml of VRBGA (which may be placed in a thermostatic water
bath for heat preservation at 46°C ± 1°C) cooled to 46°C to pour on each plate. Rotate
the plates carefully to mix up the specimen homogeneous solutions and culture media.
6.2.3 After the agar solidifies, pour a thin layer of the same culture medium to cover
characteristics more obvious.
6.2.4 Turn over the plate after the upper-layer agar solidifies on the VRBGA plate and
culture for 18 h ~ 24 h at 36°C ± 1°C.
6.3 Enumeration and confirmation of typical colonies
6.3.1 The typical colonies of Enterobacteriaceae are pink to red or violet colonies
with or without precipitation rings. Select the plates with typical colony count between
15 CFU ~ 150 CFU and without spreading growth of colonies and only enumerate the
typical colonies. The colony counting is expressed by the colony-forming unit, CFU.
9 Operating Procedures
As in 6.1.
9.2 Inoculation and culture
9.2.1 Nonselective pre-enrichment
In accordance with the estimation of the contamination of specimens and relevant limit
requirements, select 3 homogeneous specimen solution of appropriate continuous
dilution degrees, 3 test tubes for each dilution degree and altogether 9 test tubes of
BPW, and culture for 18 h ± 2 h at 36°C ± 1°C.
9.2.2 Selective enrichment
Transfer 1 ml of culture from each culture tube of BPW, inoculate in 10 ml of EE broth,
9.2.3 Separation
Use an inoculating loop to take one loop of culture from all EE broths, conduct streak
inoculation on the BRBGA plate, culture at 24 ± 2 h at 36°C ± 1°C and observe whether
there is any typical colony on the plate.
9.3 Confirmation of typical colonies
See 6.3 for the typical colonies.
10 Report
Enterobacteriaceae is Gram-negative non-spore-bearing bacillus, which ferments
glucose producing acid and is oxidase negative. Once one colony is confirmed
Look up in the MPN table (see Annex C) in accordance with the EE positive tube counts
and report the MPN values per gram (millimeter) of specimen. Report the sampling by
weight in MPN/g and the sampling by volume in MPN/ml.
Annex B
Culture Media and Reagents
B.1 Buffered peptone water (BPW)
B.1.1 Ingredients
Peptone 10.0 g
Sodium chloride 5.0 g
Potassium dihydrogen phosphate 1.5 g
Distilled water 1 000.0 ml
B.1.2 Preparation
Heat the ingredients in B.1.1 to dissolve, adjust the pH to 7.2 ± 0.2 at 25°C, load
separately into 500-ml wide-mouthed bottles with 225 ml each bottle, and conduct
autoclaved sterilization for 15 min at 121°C.
B.2 Buffered glucose brilliant green bile broth (EE broth)
B.2.1 Ingredients
Peptone 10.0 g
Disodium phosphate (anhydrous) 6.45 g
Potassium dihydrogen phosphate 2.0 g
Bile salt 20.0 g
Brilliant green 0.013 5 g
Distilled water 1 000.0 ml
B.2.2 Preparation
Dissolve the ingredients in B.2.1 in water, heat to boiling for full dissolution (heating is
preferably less than 30 min), cool the culture medium rapidly, adjust the pH to 7.2 ±
0.2 at 25°C, and load separately in sterile test tubes of 18 mm × 180 mm with 10 ml
at 5°C ± 3°C.
B.3 Crystal violet neutral red bile salt glucose agar (VRBGA)
B.3.1 Ingredients
Peptone 7.0 g
Yeast extract 3.0 g
Bile salt No. 3 1.5 g
Glucose 10.0 g
B.6 Gram stain solutions
B.6.1 Crystal violet stain so...
   
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