9秒发货/有发票 梧三标准英文版 优质技术翻译  数据库收录:159759 最近更新:2020-03-10  
支付宝/对公账号 首页   询价  购买流程  英文样品 公司简介   购物车

GB 4789.42-2016

标准搜索结果: 'GB 4789.42-2016'
标准号码内文价格(元)第2步交付天数标准名称状态
GB 4789.42-2016 英文版 870 购买 现货,9秒内自动发货PDF,有增值税发票。 食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验 有效

   
标准详细信息 GB 4789.42-2016; GB4789.42-2016
中文名称: 食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验
英文名称: Detection of norovirus in shellfish--Conventional RT-PCR and real-time RT-PCR
行业: 国家标准
中标分类: X09
字数估计: 18,173
发布日期: 2016-12-23
实施日期: 2017-06-23
旧标准 (被替代): SN/T 1635-2005
标准依据: National Health and Family Planning Commission Notice No.17 of 2016
发布机构: 中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会、国家食品药品监督管理总局

GB 4789.42-2016
Detection of norovirus in shellfish--Conventional RT-PCR and real-time RT-PCR
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品微生物学检验 诺如病毒检验
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局 发 布
前言
本标准代替SN/T 1635-2005《贝类中诺沃克病毒检测方法 普通RT-PCR方法和实时荧光RT-
PCR方法》。
本标准与SN/T 1635-2005相比,主要变化如下:
---标准名称修改为“食品安全国家标准 食品微生物学检验 诺如病毒检验”;
---标准检测范围从“贝类”扩增为“食品”;
---修改“操作步骤”;
---增加“质量控制要求”,可参见附录C;
---删除“普通RT-PCR方法”。
食品安全国家标准
食品微生物学检验 诺如病毒检验
1 范围
本标准规定了食品中诺如病毒(Norovirus)的实时荧光RT-PCR检测方法。
本标准适用于贝类,生食蔬菜,胡萝卜、瓜、坚果等硬质表面食品,草莓、西红柿、葡萄等软质水果等
食品中诺如病毒核酸的检测。
2 设备和材料
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外,其他设备和材料如下:
2.1 实时荧光PCR仪。
2.2 冷冻离心机。
2.3 无菌刀片或等效均质器。
2.4 涡旋仪。
2.5 天平:感量为0.1g。
2.6 振荡器。
2.7 水浴锅。
2.8 离心机。
2.9 高压灭菌锅。
2.10 低温冰箱:-80℃。
2.11 微量移液器。
2.12 pH计或精密pH试纸。
2.13 网状过滤袋:400mL。
2.14 无菌棉拭子。
2.15 无菌贝类剥刀。
2.16 橡胶垫。
2.17 无菌剪刀。
2.18 无菌钳子。
2.19 无菌培养皿。
2.20 无RNase玻璃容器:见E.1.2。
2.21 无RNase离心管、无RNase移液器吸嘴、无RNase药匙、无RNasePCR薄壁管:见E.1.3。
3 试剂
除有特殊说明外,所有实验用试剂均为分析纯;实验用水均为无RNase超纯水:见E.2.1。
3.1 GⅠ、GⅡ基因型诺如病毒的引物、探针:见A.1。
3.2 过程控制病毒的引物、探针:见A.1。
3.3 过程控制病毒:制备见附录C。
3.4 外加扩增控制RNA:制备见附录D。
3.5 Tris/甘氨酸/牛肉膏(TGB E)缓冲液:见E.2.2。
3.6 5×PEG/NaCl溶液(500g/L聚乙二醇PEG8000,1.5mol/LNaCl):见E.2.3。
3.7 磷酸盐缓冲液(PBS):见E.2.4。
3.8 氯仿/正丁醇的混合液:见E.2.5。
3.9 蛋白酶K溶液:见E.2.6。
3.10 75%乙醇:见E.2.7。
3.11 Trizol试剂:见E.2.8。
4 检验程序
诺如病毒检验程序见图1。
图1 诺如病毒检验程序
5 操作步骤
5.1 病毒提取
注:样品处理一般应在4℃以下的环境中进行运输。实验室接到样品后应尽快进行检测,如果暂时不能检测应将
样品保存在-80℃冰箱中,试验前解冻。样品处理和PCR反应应在单独的工作区域或房间进行。每个样品可
设置2~3个平行处理。
5.1.1 软质水果和生食蔬菜
5.1.1.1 将25g软质水果或生食蔬菜切成约2.5cm×2.5cm×2.5cm的小块(如水果或蔬菜小于该体
积,可不切)。
5.1.1.2 将样品小块移至带有400mL网状过滤袋的样品袋,加入40mLTGB E溶液(软质水果样品,
需加入30UA.niger果胶酶,或1140UA.aculeatus果胶酶),加入10μL过程控制病毒。
5.1.1.3 室温,60次/min,振荡20min。酸性软质水果需在振荡过程中,每隔10min检测pH,如pH
低于9.0时,使用1mol/LNaOH调pH至9.5,每调整一次pH,延长振荡时间10min。
5.1.1.4 将振荡液转移至离心管,如体积较大,可使用2根离心管。10000r/min,4℃,离心30min。
取上清至干净试管或三角瓶,用1mol/LHCl调pH至7.0。
5.1.1.5 加入0.25倍体积5×PEG/NaCl溶液,使终溶液浓度为100g/LPEG,0.3mol/LNaCl。60s
摇匀,4℃,60次/min,振荡60min。10000r/min,4℃,离心30min,弃上清。10000r/min,4℃,离
心5min紧实沉淀,弃上清。
录悬浮液毫升数,用于后续RNA提取。如食品样品为软质水果,将悬浮液转移至耐氯仿试管中。加入
500μL氯仿/丁醇混合液,涡旋混匀,室温静置5min。10000r/min,4℃,离心15min,将液相部分仔
细转移至干净试管,测定并记录悬浮液毫升数,用于后续RNA提取。
5.1.2 硬质表面食品
5.1.2.1 将无菌棉拭子使用PBS湿润后,用力擦拭食品表面(<100cm2)。记录擦拭面积。将10μL
过程控制病毒添加至该棉拭子。
5.1.2.2 将棉拭子浸入含490μLPBS试管中,紧贴试管一侧挤压出液体。如此重复浸入和挤压3~4次,
确保挤压出最大量的病毒,测定并记录液体毫升数,用于后续RNA提取。硬质食品表面过于粗糙,可
能会损坏棉拭子,可使用多个棉拭子。
5.1.3.1 戴上防护手套,使用无菌贝类剥刀打开至少10个贝类。
5.1.3.2 使用无菌剪刀、手术钳或其他等效器具在胶垫上解剖出贝类软体组织中的消化腺,置于干净培
养皿中。收集2.0g。
5.1.3.3 使用无菌刀片或等效均质器将消化腺匀浆后,转移至离心管。加入10μL过程控制病毒。加
入2.0mL蛋白酶K溶液,混匀。
5.1.3.4 使用恒温摇床或等效装置,37℃,320次/min,振荡60min。
5.1.3.5 将试管放入水浴或等效装置,60℃,15min。室温,3000r/min,5min离心,将上清液转移至
干净试管,测定并记录上清液mL数,用于后续RNA提取。
5.2 病毒RNA提取和纯化
间可选择性加入RNase抑制剂。操作过程中应佩戴一次性橡胶或乳胶手套,并经常更换。提取出来的RNA立
即进行反应,或保存在4℃小于8h。如果长期储存建议-80℃保存。
5.2.1 病毒裂解
将病毒提取液加入离心管,加入病毒提取液等体积Trizol试剂,混匀,激烈振荡,室温放置5min,加入
0.2倍体积氯仿,涡旋剧烈混匀30s(不能过于强烈,以免产生乳化层,也可用手颠倒混匀),12000r/min,离
心5min,上层水相移入新离心管中,不能吸出中间层。
5.2.2 病毒RNA提取
离心管中加入等体积异丙醇,颠倒混匀,室温放置5min,12000r/min,离心5min,弃上清,倒置于
吸水纸上,沾干液体(不同样品须在吸水纸不同地方沾干)。
5.2.3.1 每次加入等体积75%乙醇,颠倒洗涤RNA沉淀2次。
5.2.3.2 于4℃,12000r/min,离心10min,小心弃上清,倒置于吸水纸上,沾干液体(不同样品须在吸
水纸不同地方沾干)。或小心倒去上清液,用微量加样器将其吸干,一份样本换用一个吸头,吸头不要碰
到有沉淀,室温干燥3min,不能过于干燥,以免RNA不溶。
5.2.3.3 加入16μL无RNase超纯水,轻轻混匀,溶解管壁上的RNA,2000r/min,离心5s,冰上保存
备用。
5.3 质量控制
5.3.1 空白对照
以无RNase超纯水作为空白对照(A反应孔)。
以不含有诺如病毒的贝类,提取RNA,作为阴性对照(B反应孔)。
5.3.3 阳性对照
以外加扩增控制RNA,作为阳性对照(J反应孔)。
5.3.4 过程控制病毒
5.3.4.1 以食品中过程控制病毒RNA的提取效率表示食品中诺如病毒RNA的提取效率,作为病毒提
取过程控制。
5.3.4.2 将过程控制病毒按5.2步骤提取和纯化RNA。可大量提取,分装为10μL过程控制病毒的
RNA量,-80℃保存,每次检测时取出使用。
5.3.4.3 将10μL过程控制病毒的RNA进行数次10倍梯度稀释(D~G反应孔),加入过程控制病毒
RNA的Ct值。
5.3.4.4 以未稀释和梯度稀释过程控制病毒RNA的浓度lg值为X 轴,以其Ct值为Y 轴,建立标准曲
线;标准曲线r2 应≥0.98。未稀释过程控制病毒RNA浓度为1,梯度稀释过程控制RNA浓度分别为
10-1、10-2、10-3等。
5.3.4.5 将含过程控制病毒食品样品RNA(C反应孔),加入过程控制病毒引物、探针,采用诺如病毒实
时荧光RT-PCR反应相同的反应体系和参数,进行实时荧光RT-PCR反应,确定Ct值,代入标准曲线,
计算经过病毒提取等步骤后的过程控制病毒RNA浓度。
5.3.4.6 计算提取效率,提取效率=经病毒提取等步骤后的过程控制病毒 RNA 浓度×100%,即
(C反应孔)Ct值对应浓度×100%。
5.3.5.1 通过外加扩增控制RNA,计算扩增抑制指数,作为扩增控制。
5.3.5.2 外加扩增控制RNA分别加入含过程控制病毒食品样品RNA(H反应孔)、10-1稀释的含过程
控制病毒食品样品RNA(I反应孔)、无RNase超纯水(J反应孔),加入GⅠ或GⅡ型引物探针,采用附
录C反应体系和参数,进行实时荧光RT-PCR反应,确定Ct值。
5.3.5.3 计算扩增抑制指数,抑制指数=(含过程控制病毒食品样品RNA+外加扩增控制RNA)Ct值
-(无RNase超纯水+外加扩增控制RNA)Ct值,即抑制指数=(H反应孔)Ct值-(J反应孔)Ct值。
如抑制指数≥2.00,需比较10倍稀释食品样品的抑制指数,即抑制指数=(I反应孔)Ct值-(J反应孔)
Ct值。
5.4 实时荧光RT-PCR
同的反应总体积进行适当调整。可采用商业化实时荧光RT-PCR试剂盒。也可增加调整反应孔,实现
一次反应完成GⅠ和GⅡ型诺如病毒的独立检测。将18.5μL实时荧光RT-PCR反应体系添加至反应
孔后,不同反应孔加入下述不同物质,检测GⅠ或GⅡ基因型诺如病毒。
A反应孔:空白对照,加入5μL无RNase超纯水+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;
B反应孔:阴性对照,加入5μL阴性提取对照RNA+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;
C反应孔:病毒提取过程控制1,加入5μL含过程控制病毒食品样品RNA+1.5μL过程控制病毒
引物探针;
D反应孔:病毒提取过程控制2,加入5μL过程控制病毒RNA+1.5μL过程控制病毒引物探针;
E反应孔:病毒提取过程控制3,加入5μL10-1倍稀释过程控制病毒RNA+1.5μL过程控制病毒
F反应孔:病毒提取过程控制4,加入5μL10-2倍稀释过程控制病毒RNA+1.5μL过程控制病毒
引物探针;
G反应孔:病毒提取过程控制5,加入5μL10-3倍稀释过程控制病毒RNA+1.5μL过程控制病毒
引物探针;
H反应孔:扩增控制1,加入5μL含过程控制病毒食品样品RNA+1μL外加扩增控制 RNA+
1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;
I反应孔:扩增控制2,加入5μL10-1倍稀释的含过程控制病毒食品样品RNA+1μL外加扩增控
制 RNA+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;
J反应孔:扩增控制3/阳性对照,加入5μL无RNase超纯水+1μL外加扩增控制 RNA+1.5μL
K反应孔:样品1,加入5μL含过程控制病毒食品样品RNA+1.5μLGⅠ或GⅡ型引物探针;
L反应孔:样品2,加入5μL10-1倍稀释的含过程控制病毒食品样品RNA+1.5μLGⅠ或GⅡ型
引物探针。
6 结果与报告
6.1 检测有效性判定
6.1.1 需满足以下质量控制要求,检测方有效:空白对照阴性(A反应孔);阴性对照阴性(B反应孔);阳
性对照(J反应孔)阳性。
6.1.2 过程控制(C~G反应孔)需满足:提取效率≥1%;如提取效率<1%,需重新检测;但如提取效率
<1%,检测结果为阳性,也可酌情判定为阳性。
品的抑制指数;如10倍稀释食品样品扩增的抑制指数<2.00,则扩增有效,且需采用10倍稀释食品样
品RNA的Ct值作为结果;10倍稀释食品样品扩增的抑制指数也≥2.00时,扩增可能无效,需要重新检
测;但如抑制指数≥2.00,检测结果为阳性,也可酌情判定为阳性。
6.2 结果判定
待测样品的Ct值大于等于45时,判定为诺如病毒阴性;待测样品的Ct值小于等于38时,判定为
诺如病毒阳性;待测样品的Ct值大于38,小于45时,应重新检测;重新检测结果大于等于45时,判定
为诺如病毒阴性;小于等于38时,判定为诺如病毒阳性。
6.3 报告
根据检测结果,报告“检出诺如病毒基因”或“未检出诺如病毒基因”。
实时荧光RT-PCR引物和探针
GⅠ、GⅡ型诺如病毒实时荧光RT-PCR引物和探针见表A.1。
表A.1 GⅠ、GⅡ型诺如病毒实时荧光RT-PCR引物和探针
病毒
名称
序列
扩增产物
长度/bp
序列位置
病毒
GⅠ
QNIF4(上游引物):5’-CGCTGGATGCGNTTCCAT-3’;
NV1LCR(下游引物):5’-CCTTAGACGCCATCATCATTTAC-3’;
NVGG1p(探针):5’-FAM-TGG ACA GGA GAY CGC RAT CT-
TAMRA-3’
位于诺如病毒(GenBank登
录号 m87661)的 5291~
5376
病毒
GⅡ
QNIF2(上游引物):5’-ATGTTCAGRTGGATGAGRTTCTCWGA-3’;
COG2R(下游引物):5’-TCGACGCCATCTTCATTCACA-3’;
QNIFs(探 针):5’-FAM-AGC ACG TGG GAG GGC GAT CG-
TAMRA-3’
位于Lordsdale病毒(GenBank
登录号x86557)的5012~
5100
实时荧光RT-PCR的反应体系和参数
B.1 实时荧光RT-PCR反应体系见表B.1。
表B.1 实时荧光RT-PCR反应体系
名称 储存液浓度 终浓度
加样量/μL
GⅠ GⅡ 过程控制病毒
RT-PCR缓冲溶液 5× 1× 5 5 5
MgSO4 25mmol/L 1mmol/L 1 1 1
dNTPs 10mmol/L 0.2mmol/L 0.5 0.5 0.5
反义引物 50μmol/L 1μmol/L 0.5 0.5 0.5
逆转录酶 5U/μL 0.1U/μL 0.5 0.5 0.5
DNA聚合酶 5U/μL 0.1U/μL 0.5 0.5 0.5
探针 5μmol/L 0.1μmol/L 0.5 0.5 0.5
RNA模板 ― ― 5 5 5
水(无RNase) ― ― 11 11 11
总体积 ― ― 25 25 25
B.2 实时荧光RT-PCR反应参数见表B.2。
表B.2 实时荧光RT-PCR反应参数
RT 55°,1h 1
预热 95℃,5min 1
扩增
变性 95℃,15s
退火延伸
60℃,1min
65℃,1min
附 录 C
过程控制病毒培养及引物、探针
本标准使用过程控制病毒进行过程控制,可使用门哥病毒或其他等效,不与诺如病毒交叉反应的病
毒。门哥病毒是小核糖核酸病毒科的鼠病毒。门哥病毒株 MC0是一种重组病毒,与野生型门哥病毒
相比缺乏poly[C],是与野生型门哥病毒具有相似生长特性的无毒表型。门哥病毒株 MC0是一种转基
因生物,如果检测实验室不允许使用转基因生物,可以使用其他的过程控制病毒。也可使用商业化试剂
或试剂盒中的过程控制病毒。
C.2 培养试剂和仪器
C.2.1 HeLa细胞
推荐使用Eagle最低必需培养液(Eagle’sminimumessentialmedium,MEM)培养,并将2mmol/L
L-谷氨酸和Earle’sBSS调为1.5g/L碳酸氢钠,0.1mmol/L非必需氨基酸,1.0mmol/L丙酮酸钠,
C.2.2 仪器
为确保细胞培养和病毒生长,需细胞培养所需的CO2 浓度可调培养箱,细菌培养耗材(例如培养
皿)等。
C.3 培养过程
门哥病毒培养在铺满80%~90%单层 HeLa(ATCC􀆿CCL-2TM)细胞中,置于50mL/LCO2 的气
氛中(开放培养箱)或不可调的气氛中(封闭培养箱),直至75%出现细胞病理效应。细胞培养器皿经过
一个冻融循环,将培养物3000r/min离心10min。将细胞培养物离心上清留存用于过程控制。
C.4 引物、探针
过程控制病毒(门哥病毒)实时荧光RT-PCR的引物、探针见表C.1。采用其他等效的过程控制病
表C.1 过程控制病毒(门哥病毒)实时荧光RT-PCR的引物、探针
病毒
名称
序列
扩增产物
长度/bp
序列位置
门哥
病毒
Mengo209(下游引物):5’-GAAGTA ACATATAGACAG ACG
CACAC-3’
Mengo147(探针):5’-FAM-ATCACATTACTGGCCGAAGC-MG-
BNFQ-3’
100
位于 门 哥 病 毒 缺 失 毒 株
MC0(详见附录D)的110~
209;相当于门哥病毒非缺失
毒株 M(GenBank 登 录 号
附 录 D
外加扩增控制RNA制备1)
D.1 概要
通过将目标DNA序列连接至合适的质粒载体上,目标序列位于RNA聚合酶启动子序列的下游序
列,从而表达出外部扩增控制 RNA。GⅠ型外部扩增 RNA 序列位于诺如病毒(GenBank登录号
m87661)的5291~5376。GⅡ型外部扩增RNA序列位于Lordsdale病毒(GenBank登录号x86557)的
5012~5100。
D.2 试剂和设备
D.2.1 限制性酶:用于连接及相关的缓冲液。
D.2.3 体外RNA转录试剂(RNA聚合酶,NTPs,缓冲液等)。
D.2.4 RNase-freeDNase。
D.2.5 RNA纯化试剂。
D.2.6 DNA凝胶电泳试剂和设备。
D.2.7 培养箱:37℃。
D.3 质粒DNA连接
添加100ng~500ng纯化的目标DNA和质粒载体加入含有合适的限制酶和缓冲液的反应体系
中,限制酶和缓冲液的使用按照酶厂家推荐,并确保目标序列位于质粒中RNA聚合酶启动子序列的下
游。37℃培养120min。DNA纯化使用DNA纯化试剂纯化。使用凝胶电泳检查连接情况,比较连接
D.4 外加扩增控制RNA的表达
添加连接后的质粒至转化体系。该体系按照转化体系提供厂家建议配置。使用RNA纯化试剂纯
化RNA后,分装,-80℃储存,每次检测前取出备用。
1) 可使用等效的商业化检测试剂盒中的外加扩增控制RNA储备液,或者请生物公司代为制备。
附 录 E
RNase的去除和无RNase溶液的配制
E.1 RNase的去除
E.1.1 配制溶液用的酒精、异丙醇等应采用未开封的新品。配制溶液所用的超纯水、玻璃容器、移液器
吸嘴、药匙等用具应无RNase。操作过程中应自始自终佩戴抛弃式橡胶或乳胶手套,并经常更换,以避
E.1.2 玻璃容器应在240℃烘烤4h以去除RNase。
E.1.3 离心管、移液器吸嘴、药匙等塑料用具应用无RNase超纯水室温浸泡过夜,然后灭菌,烘干;或直
接购买无RNase的相应用具。
E.2 无RNase溶液的配制
E.2.1 无RNase超纯水
E.2.1.1 成分
超纯水 100mL
焦碳酸二乙酯(DEPC) 50μL
E.2.1.2 制法
E.2.2 Tris/甘氨酸/牛肉膏(TGB E)缓冲液
E.2.2.1 成分
Tris基质[三(羟基甲基)氨基甲烷tris(hydroxymetheyl)aminomethane] 12g
甘氨酸 3.8g
牛肉膏 10g
无RNase超纯水 总体积1000mL
E.2.2.2 制法
将固体物质溶解于水,将总体积调整至1000mL,如果有必要,25℃调节pH至7.3。高压灭菌。
E.2.3 5×PEG/氯化钠溶液(500g/LPEG8000,1.5mol/L氯化钠)
聚乙二醇(PEG)8000 500g
氯化钠 87g
无RNase超纯水 总体积1000mL
E.2.3.2 制法
将固体物质溶解在450mL的水中,如必要可缓慢加热。用水将体积调整至1000mL,混匀。高压
灭菌后备用。
E.2.4 磷酸盐缓冲液(PBS)
E.2.4.1 成分
氯化钠 8g
磷酸氢二钠 1.15g
磷酸二氢钾 0.2g
无RNase超纯水 总体积1000mL
E.2.4.2 制法
将固体物质溶解于水,如果有必要,25℃时调节pH至7.3。高压灭菌。
E.2.5 氯仿/正丁醇混合物
E.2.5.1 成分
氯仿 10mL
丁醇 10mL
将上述组分混匀。
E.2.6 蛋白酶K溶液
E.2.6.1 成分
蛋白酶K(30U/mg) 20mg
无RNase超纯水 200mL
E.2.6.2 制法
将蛋白酶K溶于水中。彻底混合。储备液-20℃保存,最多可储存6个月。一旦解冻使用,4℃
保存,1周内使用。
E.2.7 75%乙醇
无水乙醇 7.5mL
无RNase超纯水 2.5mL
E.2.7.2 制法
加无RNase超纯水2.5mL,现配现用。
E.2.8 Trizol试剂
E.2.8.1 成分
异硫氰酸胍 250g
0.75mol/L柠檬酸钠溶液(pH≥7) 17.6mL
10%十二烷基肌氨酸钠(Sarcosy)溶液 26.4mL
无RNase超纯水 293mL
重蒸苯酚 500mL
E.2.8.2 制法
在2000mL的烧杯中加入无RNase超纯水,然后依次异硫氰酸胍、柠檬酸钠溶液、十二烷基肌氨
酸钠溶液、NaAc溶液,混合均匀;加入重蒸苯酚,混合均匀。Trizol试剂需4℃低温保存,保质期约
一年。也可使用商业化的试剂。

GB 4789.42-2016
GB
NATIONAL STANDARD
OF THE PEOPLE’S REPUBLIC OF CHINA
National food safety standard -
Food microbiological examination –
Examination of norovirus
食品安全国家标准
食品中微生物学检验 - 诺如病毒检验
ISSUED ON. DECEMBER 23, 2016
IMPLEMENTED ON. JUNE 23, 2017
Issued by. National Health and Family Planning Commission of the PRC;
China Food and Drug Administration.
How to BUY & immediately GET a full-copy of this standard?
2. Search --> Add to Cart --> Checkout (3-steps);
3. No action is required - Full-copy of this standard will be automatically &
immediately delivered to your EMAIL address in 0~60 minutes.
Table of Contents
Foreword ... 3 
1 Scope ... 4 
2 Equipment and materials ... 4 
3 Reagent ... 5 
4 Testing procedures ... 6 
5 Operating procedures ... 6 
6 Results and reports ... 12 
Appendix A Real-time fluorescent RT-PCR primers and probes ... 14 
Appendix B Real-time fluorescent RT-PCR reaction system and parameters 15 
Appendix C Process control virus culture and primers, probes ... 16 
Appendix D Preparation of externally added amplification control RNA ) ... 18 
Appendix E RNase removal and RNase-free solution preparation ... 20 
Foreword
This standard replaces SN/T 1635-2005 “Detection of norovirus in shellfish -
Conventional RT-PCR and real-time RT-PCR”.
As compared with SN/T 1635-2005, the main changes of this standard are as
follows.
- CHANGE the standard name changed into “National food safety standard
- Food microbiological examination - Examination of norovirus”;
- EXTEND the standard test range from “shellfish” to “food”;
- MODIFY the “operational procedures”;
- ADD the “quality control requirements”, as shown in Appendix C;
- DELETE the “normal RT-PCR method”.
National food safety standard -
Food microbiological examination –
Examination of norovirus
1 Scope
This standard specifies real-time fluorescent RT-PCR detection method of
norovirus in food.
This standard applies to the norovirus nucleic acid detection in hard-surfaced
foods such as shellfish, raw vegetables, carrots, melons, nuts and so on AND
such soft foods as the strawberries, tomatoes, grapes and so on.
2 Equipment and materials
In addition to routine sterilization and culture equipment for microbiological
laboratories, other equipment and materials are as follows.
2.1 Real-time fluorescence PCR instrument.
2.2 Freeze centrifuge.
2.3 Sterile blade or equivalent homogenizer.
2.4 Scrollers.
2.5 Balance. sensitivity of 0.1 g.
2.6 Oscillator.
2.7 Water bath.
2.8 Centrifuge.
2.9 Autoclave pot.
2.10 Low temperature refrigerator. -80 °C.
2.11 Micro-pipettes.
2.12 pH meter or precision pH test paper.
5.1.1.2 MOVE the sample piece into a sample bag with a 400 mL mesh filter
bag; ADD 40 mL of TGBE solution (for soft fruit sample, it is needed to add 30
U of A.niger pectinase or 1140 U of A.aculeatus pectinase); ADD 10 μL of
process control virus.
5.1.1.3 At room temperature, MAKE it subject to oscillation for 20 min at the
the interval of 10 min during oscillation; if the pH is less than 9.0, USE the 1
mol/L NaOH to adjust the pH to 9.5; EXTEND the oscillation duration for 10
min every time the pH is adjusted.
5.1.1.4 TRASNFER the oscillated solution into the centrifuge tube. If the
volume is large, it may use two centrifuge tubes. CONTRIFUGE it at 4 °C for
30 min at the speed of 10000 r/min. TAKE the supernatant; PLACE it into a
clean test tube or conical flask; USE 1 mol/L HCl to adjust the pH to 7.0.
5.1.1.5 ADD 0.25 times volumes of 5 x PEG/NaCl solution so that the final
solution concentration is 100 g/L PEG and 0.3 mol/L NaCl. SHAKE it uniformly
times/min. CENTRIFUGE it at 4 °C for 30 min at the speed of 10000 r/min;
DISCARD the supernatant; CENTRIFUGE it at 4 °C for 5 min at the speed of
10000 r/min to solidify the precipitation; DISCARD the supernatant.
5.1.1.6 500 μL of PBS suspension precipitation. If the food sample is a raw
vegetable, the suspension can be transferred directly to a clean test tube, and
the millimeters of suspension is determined and recorded, for subsequent RNA
extraction. If the food sample is soft fruit, the suspension is transferred into a
chloroform-resistant test tube. ADD 500 μL of chloroform/butanol mixed
solution; MIX it uniformly in vortex; LET it stand at room temperature for 5 min.
TRANSFER the liquid phase part into a clean test tube; DETERMINE the
RECORD the millimeters of suspension, for the subsequent RNA extraction.
5.1.2 Hard surfaced food
5.1.2.1 USE PBS to wet the sterile cotton swab; WIPE the food surface (< 100
cm2) with force; RECORD the wipe area. ADD 10 μL of the process control
virus to this swab.
5.1.2.2 IMMERSE the cotton swab in a 490 μL PBS test tube; PRESS it onto
the tube wall to extrude the solution out. REPEAT the immersion and extrusion
for 3 ~ 4 times, to ensure extruding out the maximum amount of virus;
RNA extraction. Since the hard-surfaced food surface may be too rough AND it
may damage the cotton swab, so it may use several cotton swabs.
ADD the same volume of isopropyl alcohol into the centrifuge tube; MAKE it
upside down to mix it uniformly; PLACE it at room temperature for 5 min;
CENTRIFUGE it for 5 min at the speed of 12000 r/min; DISCARD the
supernatant; PLACE it upside down onto the absorbent paper to make it dry
(different samples must be dried at different positions of the absorbent paper).
5.2.3 Virus RNA purification
5.2.3.1 ADD the equal volume of 75% ethanol each time; MAKE it upside down
5.2.3.2 CENTRIFUGE it at 4 °C for 10 min at the speed of 12000 r/min;
carefully DISCARD the supernatant; PLACE it upside down on the absorbent
paper to make it dry (different samples must be dried at different positions of
the absorbent paper). Carefully POUR off the supernatant; USE the
micro-sampler to make it dry; USE one absorption tip for one sample; DO not
let the absorption tip touch the precipitation; DRY it at room temperature for 3
min; AND it shall not be over-dried to avoid RNA insoluble.
5.2.3.3 ADD 16 μL of RNase-free ultrapure water; MIX it uniformly and gently;
DISSOLVE the RNA on the tube wall; CENTRIFUGE it for 5 s at the speed of
5.3 Quality control
5.3.1 Blank control
USE the RNase-free ultrapure water as a blank control (A reaction hole).
5.3.2 Negative control
EXTRACT the RNA from the shellfish containing no norovirus as a negative
control (B reaction hole).
5.3.3 Positive control
USE the externally added amplification control RNA as a positive control (J
reaction hole).
5.3.4.1 USE the extraction efficiency of the process control virus RNA in the
food to indicate the extraction efficiency of the norovirus RNA in the food, as
the virus extraction process control.
5.3.4.2 EXTRACT and PURIFY the RNA of the process control virus in
accordance with the procedures in 5.2. It may extract it in large amount;
added amplification control RNA) Ct value, that is, the inhibition index = (H
reaction hole) Ct value - (J reaction hole) Ct value. If the inhibition index is ≥
2.00, it shall compare the inhibition index of the 10-fold diluted food sample,
that is, the inhibition index = (I reaction hole) Ct value - (J reaction hole) Ct
5.4 Real-time fluorescent RT-PCR
Real-time RT-PCR reaction system and reaction parameters are described in
Appendix B. The amount of each reagent in the reaction system can be
appropriately adjusted depending on the particular situation or the different
total reaction volume. A commercially available real-time fluorescent RT-PCR
kit can be used. It can also increase and adjust the reaction hole to realize the
independent detection of the GI type and GII type norovirus in one time. After
adding the 18.5 μL of real-time fluorescent RT-PCR reaction system into the
reaction hole, ADD the following substances into different reaction holes to
A reaction hole. blank control, ADD 5 µL of RNase-free ultrapure water + 1.5
µL of GI or GII type primer probe;
B reaction hole. negative control, ADD 5 µL of negative extraction control RNA
+ 1.5 µL of GI or GII type primer probe;
C reaction hole. virus extraction process control 1, ADD 5 μL of process control
virus contained food sample RNA + 1.5 μL of process control virus primer
probe;
D reaction hole. virus extraction process control 2, ADD 5 μL of process control
virus RNA + 1.5 μL of process control virus primer probe;
dilution process control virus RNA + 1.5 μL of process control virus primer
probe;
F reaction hole. virus extraction process control 4, ADD 5μL of 10-2 fold dilution
process control virus R...
   
宁德梧三商贸有限公司 | 纳税人识别号:91350900MA32WE2Q2X | 营业执照:营业执照证书
点击联络我们 联系电邮郑文锐销售经理: Sales@gb-gbt.cn | Sales@ChineseStandard.net | 电话郑经理: 18059327808 | 增值税普通发票 / 增值税专用发票样品
对公开户银行:中国建设银行古田支行 | 账户名称:宁德梧三商贸有限公司 | 账号:35050168730700000955 对公银行账号证书
翻译支持:全资母公司新加坡场测亚洲公司(https://www.ChineseStandard.net 卖欧美后再内销)
网站备案许可:闽ICP备19012676号 http://www.beian.miit.gov.cn
隐私   ·  优质产品   ·  退款政策   ·  公平交易   ·  关于我们