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GB 5009.222-2016

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标准编号: GB 5009.222-2016 (GB5009.222-2016)
中文名称: 食品安全国家标准 食品中桔青霉素的测定
英文名称: Determination of citrinin in Monascus products
行业: 国家标准
中标分类: X09
发布日期: 2016-12-23
实施日期: 2017-06-23
旧标准 (被替代): GB/T 5009.222-2008; SN/T 2426-2010; SN/T 2916-2011
标准依据: National Health and Family Planning Commission Notice No.17 of 2016

GB 5009.222-2016
Determination of citrinin in Monascus products
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品中桔青霉素的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局 发 布
前言
本标准代替GB/T 5009.222-2008《红曲类产品中桔青霉素的测定》、SN/T 2426-2010《进出口粮
谷中桔霉素含量检测方法 液相色谱法》和SN/T 2916-2011《出口食品中桔霉素的测定方法 免疫
亲和柱净化-高效液相色谱法》。
本标准与GB/T 5009.222-2008相比,主要变化如下:
---标准名称修改为“食品安全国家标准食品中桔青霉素的测定”;
---增加了净化步骤;
---增加了适用范围。
食品安全国家标准
食品中桔青霉素的测定
1 范围
本标准规定了食品中桔青霉素的测定方法。
本标准第一法适用于大米、玉米、辣椒、红曲类产品中桔青霉素的测定,第二法适用于大米、大麦、燕
麦、小麦中桔青霉素的测定。
第一法 免疫亲和柱净化-高效液相色谱法
2 原理
试样中的桔青霉素用甲醇-水提取,提取液经过滤、稀释后,用免疫亲和柱净化,采用液相色谱结合
荧光检测器测定桔青霉素的含量,外标法定量。
3 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB 6682规定的二级水。
3.1 试剂
3.1.1 甲醇(CH3OH):色谱纯。
3.1.2 乙腈(CH3CN):色谱纯。
3.1.3 磷酸(H3PO4):色谱纯。
3.1.4 冰乙酸(C2H4O2):色谱纯。
3.1.5 氢氧化钠(NaOH)。
3.1.6 吐温20(C58H114O26)。
3.1.7 氯化钠(NaCl)。
3.1.8 磷酸氢二钠(Na2HPO4)。
3.1.9 磷酸二氢钾(KH2PO4)。
3.1.10 氯化钾(KCl)。
3.2 试剂配制
3.2.1 氢氧化钠溶液(2mol/L):称取80.0g固体氢氧化钠,溶于1L水中。
3.2.2 磷酸溶液(10mmol/L,pH7.5):准确移取1.376mL磷酸加水定容至2000mL,用2mol/L的
氢氧化钠溶液调节pH至7.5。
3.2.3 磷酸溶液(10mmol/L,pH2.5):准确移取1.376mL磷酸加水定容至2000mL,用2mol/L的
氢氧化钠溶液调节pH至2.5。
3.2.4 PBS缓冲溶液:称取8.0g氯化钠、1.2g磷酸氢二钠、0.2g磷酸二氢钾、0.2g氯化钾,用水溶解,
调节pH至7.0,用水定容至1000mL。
3.2.5 0.1%吐温20-PBS溶液:准确移取1mL吐温20以PBS缓冲溶液定容至1000mL。
3.2.6 0.1%磷酸溶液:准确移取1mL磷酸加水定容至1000mL。
3.2.7 洗脱液Ⅰ:甲醇-10mmol/L磷酸溶液(pH2.5)(70+30)。
3.2.8 洗脱液Ⅱ:甲醇-0.1%磷酸溶液(70+30)。
3.3 标准品
桔青霉素(C13H14O5,CAS号:518-75-2),纯度≥99.0%。或经国家认证并授予标准物质证书的标
准物质。
3.4 标准溶液配制
3.4.1 标准储备液:准确称取一定量的桔青霉素标准品,以甲醇溶解并定容至10.0mL作为标准储备
液,浓度为100μg/mL,于4℃下保存。
3.4.2 标准中间液:准确移取1.0mL桔青霉素标准储备液于10mL容量瓶中,用甲醇定容,浓度为
10μg/mL,于4℃下保存。
3.4.3 基质标准工作液:根据需要,取适量的标准中间液,用空白样品提取液配成不同浓度的基质标准
工作液,现用现配。
3.5 材料
3.5.1 桔青霉素免疫亲和柱:柱体积3mL,最大柱容量20ng,或等效柱。
3.5.2 玻璃纤维滤纸:直径11cm,孔径1.5μm。
4 仪器和设备
4.1 高效液相色谱仪,配荧光检测器。
4.2 分析天平:感量0.0001g和0.01g。
4.3 高速均质器:≥12000r/min。
4.4 混匀器。
5 分析步骤
5.1 提取
5.1.1 大米、玉米、辣椒
称取经充分粉碎均质试样10.0g(精确至0.1g)于150mL具塞锥形瓶中,加入50mL甲醇-水
(70+30)提取液,以高速均质器高速均质提取2min,过滤提取液,移取1.0mL滤液,置于另一干净的
容器中,加入49mL10mmol/L磷酸溶液(pH7.5)稀释、混匀;以玻璃纤滤纸过滤待免疫亲和柱净化。
5.1.2 红曲及其制品
称取经充分粉碎均质试样1.0g(精确至0.1g)于50mL具塞锥形瓶中,加入20mL甲醇-水
(70+30)提取液,以高速均质器高速均质提取2min,过滤提取液,移取1.0mL滤液,置于另一干净的
容器中,加入39mLPBS缓冲溶液稀释、混匀;以玻璃纤滤纸过滤待免疫亲和柱净化。
5.2.1 大米、玉米、辣椒
将免疫亲和柱连接于10mL玻璃针筒下,准确移取10.0mL(相当于0.04g试样)上述澄清滤液过
免疫亲和柱,以1滴/s~2滴/s的流速全部通过亲和柱;加入5mL10mmol/L磷酸(pH7.5)以1滴/s~
2滴/s的流速淋洗柱子,直至空气进入到亲和柱中,弃去全部流出液。准确加入1.0mL洗脱液Ⅰ进行
洗脱,洗脱流速为1滴/s~2滴/s。收集全部洗脱液于玻璃试管中,供检测用。
5.2.2 红曲及其制品
将免疫亲和柱连接于10mL玻璃针筒下,准确移取10.0mL上述澄清滤液过免疫亲和柱,以1滴/s~
2滴/s的流速全部通过亲和柱;加入10mL0.1%吐温20-PBS溶液,以1滴/s~2滴/s的流速淋洗柱
子,直至空气进入到亲和柱中,弃去全部流出液。准确加入1.0mL洗脱液Ⅱ(红曲及其制品)进行洗
5.3 空白试验
除不加试样外,均按上述操作步骤进行。
5.4 测定
5.4.1 液相色谱参考条件
5.4.1.1 大米、玉米、辣椒
液相色谱分析条件列出如下:
a) 色谱柱:C18柱,柱长150mm,内径4.6mm,粒径5μm,或等效柱;
b) 柱温:30℃;
c) 流速:1.0mL/min;
e) 检测条件:激发波长350nm,发射波长500nm;
f) 流动相A液:乙腈,流动相B液:10mmol/L磷酸(pH2.5)。
流动相及梯度洗脱条件见表1。
表1 流动相及梯度洗脱条件
时间/min 流动相A液/% 流动相B液/%
5.4.1.2 红曲及其制品
液相色谱分析条件列出如下:
a) 色谱柱:C18柱,柱长150mm,内径4.6mm,粒径5μm,或等效柱;
b) 柱温:30℃;
d) 进样量:50μL;
e) 检测条件:激发波长350nm,发射波长500nm;
f) 流动相A液:乙腈,流动相B液:0.1%磷酸。
流动相及梯度洗脱条件见表2。
表2 流动相及梯度洗脱条件
时间/min 流动相A液/% 流动相B液/%
5.4.2 标准曲线的制作
配制0.0ng/mL、1.0ng/mL、2.0ng/mL、5.0ng/mL、10.0ng/mL、20.0ng/mL6个浓度的基质标
准工作液。在仪器最佳工作条件下,用基质标准工作溶液分别进样,以相应的桔青霉素的色谱峰的峰面
桔青霉素标准的色谱图参见图A.1和图A.2。
5.4.3 试样溶液的测定
将试样溶液注入高效液相色谱仪,测定相应的峰面积。由标准曲线得到试样溶液中桔青霉素的
浓度。
6 分析结果的表述
试样中桔青霉素含量按式(1)计算:
X=ρ×
V×f
(1)
X ---试样中桔青霉素的含量,单位为微克每千克(μg/kg);
ρ ---样液中桔青霉素的浓度,单位为微克每升(μg/L);
V ---定容体积,单位为毫升(mL);
f ---样液稀释倍数;
m ---样液所代表的试样量,单位为克(g)。
计算结果需扣除空白值。计算结果保留两位有效数字。
7 精密度
在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
8 其他
检出限和定量限分别为25μg/kg和80μg/kg。
第二法 C18固相萃取小柱净化-高效液相色谱法
9 原理
用乙腈-异丙醇-水的混合溶液提取试样中桔青霉素,C18固相萃取小柱净化,用配荧光检测器的液
相色谱仪测定,外标法定量。
10 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB 6682规定的二级水。
10.1 试剂
10.1.1 异丙醇(C3H8O):色谱纯。
10.1.3 磷酸(H3PO4):优级纯。
10.1.4 甲醇(CH3OH)。
10.2 试剂配制
10.2.1 提取溶剂:乙腈-异丙醇-水(35+10+55),用磷酸调pH为1.5。
10.2.2 磷酸溶液(0.08mol/L):取5.6mL磷酸,以水定容至1L。
10.2.3 流动相:乙腈-异丙醇-磷酸溶液(35+10+55)。
10.3 标准品
桔青霉素(C13H14O5,CAS号:518-75-2),纯度≥99%。或经国家认证并授予标准物质证书的标准
物质。
10.4.1 桔青霉素标准储备液:称取适量桔青霉素标准物质,用乙腈溶解并定容至1.0mg/mL,0℃~
4℃ 保存。
10.4.2 桔青霉素标准工作液:根据需要用流动相将标准储备液稀释成25ng/mL、50ng/mL、100ng/mL、
500ng/mL、1000ng/mL的标准工作溶液。
10.5 材料
10.5.1 C18固相萃取柱:填料500mg,柱体积3mL,或等效柱。
10.5.2 玻璃纤维滤纸:直径11cm,孔径1.5μm。
11 仪器和设备
11.1 高效液相色谱仪:配有荧光检测器。
11.3 离心机:≥6500r/min。
11.4 真空固相萃取装置。
11.5 氮吹仪。
11.6 分析天平:感量0.0001g和0.01g。
12 分析步骤
12.1 提取
取样品500g,用粉碎机粉碎并通过830μm圆孔筛,混匀,分成2份,装入洁净容器内,密封保存。
称取试样约5g(精确至0.01g)于50mL离心管中,加10mL提取溶剂(10.2.1),在振荡器上振荡提取
30min。以3500r/min离心4min,上清液转入另一离心管中。在残渣中再加入5mL提取溶剂
纸,待净化。
12.2 净化
将上述溶液过预淋洗好的C18固相萃取柱,用5mL水淋洗柱子。待淋洗液全部流出柱子后,减压
抽干3min。用10mL甲醇以1.0mL/min的速度洗脱,收集全部洗脱液,在40℃下,N2 吹干,再以
1.0mL流动相溶解,过0.22μm的有机相微孔滤膜,供液相色谱测定。
12.3 空白试验
除不加试样外,均按上述操作步骤进行。
12.4 测定
12.4.1 液相色谱参考条件
b) 流动相:乙腈-异丙醇-磷酸溶液(35+10+55);
c) 流速:1.0mL/min;
d) 进样量:50μL;
e) 柱温:28℃;
f) 检测波长:激发波长331nm,发射波长500nm。
12.4.2 色谱测定
根据样液中被测桔青霉素含量情况,选定峰面积相近的标准工作溶液。标准工作液和样液中桔青
霉素响应值均应在仪器检测线性范围内。对标准工作液和样液等体积参插进样测定。在上述色谱条件
下,桔青霉素保留时间约为9.1min,标准物质色谱图见图A.3。
试样中桔青霉素含量按式(2)计算:
X=
A×ρ×V
As×m
(2)
式中:
X ---试样中桔青霉素含量,单位为微克每千克(μg/kg);
A ---样液中桔青霉素的峰面积;
ρ ---标准工作液中桔青霉素的浓度,单位为微克每升(μg/L);
As---标准工作液中桔青霉素的峰面积;
m ---最终样液所代表的试样量,单位为克(g)。
计算结果需扣除空白值,测定结果用平行测定的算术平均值表示,结果保留两位有效数字。
14 精密度
在重复条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
15 其他
方法检出限为3μg/kg,定量限为10μg/kg。
附 录 A
桔青霉素标准的液相色谱图
图A.1 桔青霉素标准溶液(100ng/mL)液相色谱图(玉米基质标准工作液)
图A.2 桔青霉素标准溶液(100ng/mL)液相色谱图(红曲基质标准工作液)
图A.3 桔青霉素标准溶液(100ng/mL)的液相色谱图

GB 5009.222-2016
NATIONAL STANDARD OF THE
PEOPLE’S REPUBLIC OF CHINA
National Food Safety Standard -
Determination of Citrinin in Foods
食品安全国家标准
食品中桔青霉素的测定
ISSUED ON: DECEMBER 23, 2016
IMPLEMENTED ON: JUNE 23, 2017
Issued by: National Health and Family Planning Commission of the
People’s Republic of China;
China Food and Drug Administration.
Table of Contents
Foreword ... 3 
1 Scope ... 4 
2 Principle ... 4 
3 Reagents and materials ... 4 
4 Instruments and apparatuses ... 6 
5 Analysis steps ... 6 
6 Description of the analysis result ... 9 
7 Precision ... 9 
8 Others ... 10 
9 Principle ... 10 
10 Reagents and materials ... 10 
11 Instruments and apparatuses ... 11 
12 Analysis steps ... 11 
13 Description of the analysis result ... 12 
14 Precision ... 13 
15 Others ... 13 
Appendix A Liquid chromatogram of citrinin standard solution ... 14 
National Food Safety Standard -
Determination of Citrinin in Foods
1 Scope
This Standard specifies methods for the determination of citrinin in foods.
Method 1 of this standard is applicable to the determination of citrinin in rice,
corn, pepper and red yeast products; method 2 is applicable to the
determination of citrinin in rice, barley, oats and wheat.
Method 1 -- Immunoaffinity column purification - high
performance liquid chromatography
2 Principle
For the citrinin in the sample, use methanol-water to extract; filter and dilute the
extract; use the immunoaffinity column to purify; use the liquid chromatography
and the fluorescence detector to determine the content of citrinin; use the
external standard method to quantify.
3 Reagents and materials
Unless otherwise specified, all the reagents in this method are analytical
reagents; the water is grade-II water that is specified by GB/T 6682.
3.1 Reagents
3.1.1 Methanol (CH3OH): chromatographic pure.
3.1.2 Acetonitrile (CH3CH): chromatographic pure.
3.1.3 Phosphoric acid (H3PO4): chromatographic pure.
3.1.4 Glacial acetic acid (C2H4O2): chromatographic pure.
3.1.5 Sodium hydroxide (NaOH).
3.1.6 Tween-20 (C58H114O26).
3.4.2 Standard intermediate solution: accurately transfer 1.0 mL of the citrinin
standard stock solution in a 10 mL volumetric flask; use methanol to fix-volume;
the concentration is 10 μg/mL; store at 4°C.
3.4.3 Matrix standard working solution: according to the need, take an
appropriate amount of standard intermediate solution; use blank sample extract
to prepare matrix standard working solutions of different concentrations.
Prepare when needed.
3.5 Materials
3.5.1 Citrinin immunoaffinity column: column volume of 3 mL, maximum column
capacity of 20 ng, or equivalent column.
3.5.2 Glass-fiber filter paper: diameter of 11 cm; aperture of 1.5 μm.
4 Instruments and apparatuses
4.1 High performance liquid chromatography, with fluorescence detector.
4.2 Analytical balance: sensitivity of 0.000 1 g and 0.01 g.
4.3 High-speed homogenizer: ≥12 000 r/min.
4.4 Mixer.
5.1 Extraction
5.1.1 Rice, corn, pepper
Weigh 10.0 g (accurate to 0.1 g) of the fully pulverized homogeneous sample
into a 150 mL stoppered conical flask; add 50 mL of methanol-water (70+30)
extract; use high-speed homogenizer to extract for 2 min at high speed; filter
the extract; transfer 1.0 mL of the filtrate to another clean container; add 49 mL
of 10 mmol/L phosphoric acid solution (pH 7.5) to dilute and mix; use a glass-
fiber filter paper to filter the to-be-purified immunoaffinity column.
5.1.2 Red yeast and its products
into a 50 mL stoppered conical flask; add 20 mL of methanol-water (70+30)
extract; use high-speed homogenizer to extract for 2 min at high speed; filter
the extract; transfer 1.0 mL of the filtrate to another clean container; add 39 mL
Prepare matrix standard working solutions of 6 concentrations, namely 0.0
ng/mL, 1.0 ng/mL, 2.0 ng/mL, 5.0 ng/mL, 10.0 ng/mL, and 20.0 ng/mL. Under
the optimal working conditions of the instrument, use the matrix standard
working solution for injection respectively; take the chromatographic peak area
of the corresponding citrinin as the ordinate, and the concentration of citrinin in
the matrix standard working solution as the abscissa to draw the standard curve.
5.4.3 Determination of sample solution
Inject the sample solution into the high performance liquid chromatography to
determine the corresponding peak area. Obtain the concentration of citrinin in
the sample solution from the standard curve.
6 Description of the analysis result
Calculate the content of citrinin in the sample according to Formula (1):
Where:
X -- the content of citrinin in the sample, in micrograms per kilogram (μg/kg);
ρ -- the concentration of citrinin in the sample solution, in micrograms per liter
V -- constant volume, in milliliters (mL);
f -- the dilution factor of the sample solution;
m -- the sample amount that is represented by the sample solution, in grams
(g).
The calculation result needs to be deducted from the blank value. The
calculation result shall keep two significant figures.
7 Precision
The absolute difference of two independent test results under repeatability
cannot exceed 10% of the arithmetic mean value.
Citrinin (C13H14O5, CAS No.: 518-75-2), purity ≥ 99%. or the standard substance
that is certified by the state and awarded with the standard substance certificate.
10.4 Preparation of standard solution
10.4.1 Citrinin standard stock solution: weigh an appropriate amount of citrinin
standard substance; use acetonitrile to dissolve and fix-volume to 1.0 mg/mL;
store at 0°C ~ 4°C.
10.4.2 Citrinin standard working solution: use the mobile phase to dilute the
standard stock solution into standard working solution of 25 ng/mL, 50 ng/mL,
100 ng/mL, 500 ng/mL, 1000 ng/mL as needed.
10.5.1 C18 solid phase extraction column: packing of 500 mg, column volume
of 3 mL, or equivalent column.
10.5.2 Glass-fiber filter paper: diameter of 11 cm; aperture of 1.5 μm.
11 Instruments and apparatuses
11.1 High performance liquid chromatography, with fluorescence detector.
11.2 Oscillator.
11.3 Centrifuge: ≥ 6 500 r/min.
11.4 Vacuum solid-phase extraction device.
11.5 Nitrogen-blowing instrument.
12 Analysis steps
12.1 Extraction
Take 500 g of sample; use a pulverizer to pulverize; pass through an 830 μm
round sieve; mix well; divide into 2 portions; place in a clean container; seal and
store. Weigh approximately 5 g (accurate to 0.01 g) of the sample into a 50 mL
centrifuge tube; add 10 mL of extraction solvent (10.2.1); extract for 30 min on
the shaker. Centrifugate at 3 500 r/min for 4 min; transfer the supernatant to
another centrifuge tube. Add another 5 mL of extraction solvent (10.2.1) to the
residue; repeat the above operation; combine the supernatant. Add water to the
   
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