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GB 5009.83-2016

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GB 5009.83-2016 英文版 310 购买 现货,9秒内自动发货PDF,有增值税发票。 食品安全国家标准 食品中胡萝卜素的测定 有效

   
标准编号: GB 5009.83-2016 (GB5009.83-2016)
中文名称: 食品安全国家标准 食品中胡萝卜素的测定
英文名称: National food safety standard Determination of β-carotene in foods for infants and young children, milk and milk products
行业: 国家标准
中标分类: X09
发布日期: 2016-12-23
实施日期: 2017-06-23
旧标准 (被替代): GB 5413.35-2010; GB/T 5009.83-2003; NY/T 82.15-1988
标准依据: National Health and Family Planning Commission Notice No.17 of 2016

GB 5009.83-2016
National food safety standard Determination of β-carotene in foods for infants and young children, milk and milk products
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品中胡萝卜素的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局 发 布
前言
本标准代替GB5413.35-2010《食品安全国家标准婴幼儿食品和乳品中β-胡萝卜素的测定》、
GB/T 5009.83-2003《食品中胡萝卜素的测定》和NY/T 82.15-1988《果汁测定方法 β-胡萝卜素的
测定》。
本标准与GB 5413.35-2010相比,主要变化如下:
---标准名称修改为“食品安全国家标准食品中胡萝卜素的测定”;
---增加了普通食品的前处理方法;
---增加了需要区分α-胡萝卜素、β-胡萝卜素的色谱条件;
---修改了胡萝卜素的结果表达。
食品安全国家标准
食品中胡萝卜素的测定
1 范围
本标准规定了食品中胡萝卜素的测定方法。
本标准色谱条件一适用于食品中α-胡萝卜素、β-胡萝卜素及总胡萝卜素的测定,色谱条件二适用于
食品中β-胡萝卜素的测定。
2 原理
试样经皂化使胡萝卜素释放为游离态,用石油醚萃取二氯甲烷定容后,采用反相色谱法分离,外标
法定量。
3 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
3.1 试剂
3.1.1 α-淀粉酶:酶活力≥1.5U/mg。
3.1.2 木瓜蛋白酶:酶活力≥5U/mg。
3.1.3 氢氧化钾(KOH)。
3.1.4 无水硫酸钠(Na2SO4)。
3.1.5 抗坏血酸(C6H8O6)。
3.1.6 石油醚:沸程30℃~60℃。
3.1.7 甲醇(CH4O):色谱纯。
3.1.8 乙腈(C2H3N):色谱纯。
3.1.9 三氯甲烷(CHCl3):色谱纯。
3.1.10 甲基叔丁基醚[CH3OC(CH3)3]:色谱纯。
3.1.11 二氯甲烷(CH2Cl2):色谱纯。
3.1.12 无水乙醇(C2H6O):优级纯。
3.1.13 正己烷(C6H14):色谱纯。
3.1.14 2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚(C15H24O,BHT)。
3.2 试剂配制
氢氧化钾溶液:称固体氢氧化钾500g,加入500mL水溶解。临用前配制。
3.3 标准品
3.3.1 α-胡萝卜素(C40H56,CAS号:7488-99-5):纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标
准物质。
3.3.2 β-胡萝卜素(C40H56,CAS号:7235-40-7):纯度≥95%,或经国家认证并授予标准物质证书的标
准物质。
3.4 标准溶液配制
3.4.1 α-胡萝卜素标准储备液(500μg/mL):准确称取α-胡萝卜素标准品50mg(精确到0.1mg),加入
0.25gBHT,用二氯甲烷溶解,转移至100mL棕色容量瓶中定容至刻度。于-20℃以下避光储存,使
用期限不超过3个月。标准储备液用前需进行标定,具体操作见附录A。
3.4.2 α-胡萝卜素标准中间液(100μg/mL):由α-胡萝卜素标准储备液中准确移取10.0mL溶液于
50mL棕色容量瓶中,用二氯甲烷定容至刻度。
3.4.3 β-胡萝卜素标准储备液(500μg/mL):准确称取β-胡萝卜素标准品50mg(精确到0.1mg),加入
0.25gBHT,用二氯甲烷溶解,转移至100mL棕色容量瓶中定容至刻度。于-20℃以下避光储存,使
用期限不超过3个月。标准储备液用前需进行标定,具体操作见附录A。
注:β-胡萝卜素标准品主要为全反式(al-E)β-胡萝卜素,在储存过程中受到温度、氧化等因素的影响,会出现部分
全反式β-胡萝卜素异构化为顺式β-胡萝卜素的现象,如9-顺式(9Z)-β-胡萝卜素、13-顺式(13Z)-β-胡萝卜素、
15-顺式(15Z)-β-胡萝卜素等。如果采用色谱条件一进行β-胡萝卜素的测定,应按照附录B确认β-胡萝卜素异
构体保留时间,并计算全反式β-胡萝卜素标准溶液色谱纯度。
3.4.4 β-胡萝卜素标准中间液(100μg/mL):从β-胡萝卜素标准储备液中准确移取10.0mL溶液于
50mL棕色容量瓶中,用二氯甲烷定容至刻度。
3.4.5 α-胡萝卜素、β-胡萝卜素混合标准工作液(色谱条件一用):准确移取α-胡萝卜素标准中间液
0.50mL、1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、10.00mL溶液至6个100mL棕色容量瓶,分别加入
3.00mLβ-胡萝卜素中间液,用二氯甲烷定容至刻度,得到α-胡萝卜素浓度分别为0.5μg/mL、
1.0μg/mL、2.0μg/mL、3.0μg/mL、4.0μg/mL、10.00μg/mL,β-胡萝卜素浓度均为3.0μg/mL的系列
混合标准工作液。
3.4.6 β-胡萝卜素标准工作液(色谱条件二用):从β-胡萝卜素标准中间液中分别准确移取0.50mL、
1.00mL、2.00mL、3.00mL、4.00mL、10.00mL溶液至6个100mL棕色容量瓶。用二氯甲烷定容至
刻度,得到浓度为0.5μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、3.0μg/mL、4.0μg/mL、10μg/mL的系列标准
工作液。
4 仪器和设备
4.1 匀浆机。
4.2 高速粉碎机。
4.3 恒温振荡水浴箱:控温精度±1℃。
4.4 旋转蒸发器。
4.6 紫外-可见光分光光度计。
4.7 高效液相色谱仪(HPLC仪):带紫外检测器。
5 分析步骤
注:整个实验操作过程应注意避光。
5.1 试样制备
谷物、豆类、坚果等试样需粉碎、研磨、过筛(筛板孔径0.3mm~0.5mm);蔬菜、水果、蛋、藻类等试
样用匀质器混匀;固体粉末状试样和液体试样用前振摇或搅拌混匀。4℃冰箱可保存1周。
5.2 试样处理
5.2.1 普通食品试样
蔬菜、水果、菌藻类、谷物、豆类、蛋类等普通食品试样准确称取混合均匀的试样1g~5g(精确至
0.001g),油类准确称取0.2g~2g(精确至0.001g),转至250mL锥形瓶中,加入1g抗坏血酸、75mL
无水乙醇,于60℃±1℃水浴振荡30min。
如果试样中蛋白质、淀粉含量较高(>10%),先加入1g抗坏血酸、15mL45℃~50℃温水、0.5g
木瓜蛋白酶和0.5gα-淀粉酶,盖上瓶塞混匀后,置55℃±1℃恒温水浴箱内振荡或超声处理30min
后,再加入75mL无水乙醇,于60℃±1℃水浴振荡30min。
5.2.1.2 皂化
加入25mL氢氧化钾溶液,盖上瓶塞。置于已预热至53℃±2℃恒温振荡水浴箱中,皂化30min。
取出,静置,冷却到室温。
5.2.2.1 预处理
固体试样:准确称取1g~5g(精确至0.001g),置于250mL锥形瓶中,加入1g抗坏血酸,加
50mL45℃~50℃温水混匀。加入0.5g木瓜蛋白酶和0.5gα-淀粉酶(无淀粉试样可以不加α-淀粉
酶),盖上瓶塞,置55℃±1℃恒温水浴箱内振荡或超声处理30min。
液体试样:准确称取5g~10g(精确至0.001g),置于250mL锥形瓶中,加入1g抗坏血酸。
5.2.2.2 皂化
取预处理后试样,加入75mL无水乙醇,摇匀,再加入25mL氢氧化钾溶液,盖上瓶塞。置于已预
热至53℃±2℃恒温振荡水浴箱中,皂化30min。取出,静置,冷却到室温。
注:如皂化不完全可适当延长皂化时间至1h。
将皂化液转入500mL分液漏斗中,加入100mL石油醚,轻轻摇动,排气,盖好瓶塞,室温下振荡
10min后静置分层,将水相转入另一分液漏斗中按上述方法进行第二次提取。合并有机相,用水洗至
近中性。弃水相,有机相通过无水硫酸钠过滤脱水。滤液收入500mL蒸发瓶中,于旋转蒸发器上
40℃±2℃减压浓缩,近干。用氮气吹干,用移液管准确加入5.0mL二氯甲烷,盖上瓶塞,充分溶解提
取物。经0.45μm膜过滤后,弃出初始约1mL滤液后收集至进样瓶中,备用。
注:必要时可根据待测样液中胡萝卜素含量水平进行浓缩或稀释,使待测样液中α-胡萝卜素和/或β-胡萝卜素浓度
在0.5μg/mL~10μg/mL范围内。
5.4 色谱测定
5.4.1 色谱条件一(适用于食品中α-胡萝卜素、β-胡萝卜素及总胡萝卜素的测定)
参考色谱条件列出如下:
a) 色谱柱:C30柱,柱长150mm,内径4.6mm,粒径5μm,或等效柱;
b) 流动相:A相:甲醇∶乙腈∶水=73.5∶24.5∶2;
B相:甲基叔丁基醚;
表1 梯度程序
时间/min 0 15 18 19 20 22
A% 100 59 20 20 0 100
B% 0 41 80 80 100 0
c) 流速:1.0mL/min;
e) 柱温:30℃±1℃;
f) 进样体积:20μL。
5.4.1.2 绘制α-胡萝卜素标准曲线、计算全反式β-胡萝卜素响应因子
将α-胡萝卜素、β-胡萝卜素混合标准工作液注入 HPLC仪中(色谱图见图C.1),根据保留时间定
性,测定α-胡萝卜素、β-胡萝卜素各异构体峰面积。
α-胡萝卜素根据系列标准工作液浓度及峰面积,以浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,
计算回归方程。
β-胡萝卜素根据标准工作液标定浓度、全反式β-胡萝卜素6次测定峰面积平均值、全反式β-胡萝卜
素色谱纯度(CP,计算方法见附录B),按式(1)计算全反式β-胡萝卜素响应因子。
Aal-E
ρ×CP
(1)
式中:
RF ---全反式β-胡萝卜素响应因子,单位为峰面积毫升每微克(AU·mL/μg);
Aal-E ---全反式β-胡萝卜素标准工作液色谱峰峰面积平均值,单位为峰面积(AU);
ρ ---β-胡萝卜素标准工作液标定浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
CP ---全反式β-胡萝卜素的色谱纯度,%。
5.4.1.3 试样测定
α-胡萝卜素根据标准曲线回归方程计算待测液中α-胡萝卜素浓度,β-胡萝卜素根据全反式β-胡萝卜素
响应因子进行计算。
5.4.2 色谱条件二(适用食品中β-胡萝卜素的测定)
5.4.2.1 参考色谱条件
参考色谱条件列出如下:
a) 色谱柱:C18柱,柱长250mm,内径4.6mm,粒径5μm,或等效柱;
b) 流动相:三氯甲烷∶乙腈∶甲醇=3∶12∶85,含抗坏血酸0.4g/L,经0.45μm膜过滤后备用;
c) 流速:2.0mL/min;
d) 检测波长:450nm;
f) 进样体积:20μL。
5.4.2.2 标准曲线的制作
将β-胡萝卜素标准工作液注入HPLC仪中(色谱图见图C.2),以保留时间定性,测定峰面积。以标
准系列工作液浓度为横坐标,峰面积为纵坐标绘制标准曲线,计算回归方程。
5.4.2.3 试样测定
在相同色谱条件下,将待测试样液分别注入液相色谱仪中,进行 HPLC分析,以保留时间定性,根
据峰面积外标法定量,根据标准曲线回归方程计算待测液中β-胡萝卜素的浓度。
注:本色谱条件适用于α-胡萝卜素含量较低(小于总胡萝卜素10%)的食品试样中β-胡萝卜素的测定。
6 分析结果的表述
试样中α-胡萝卜素含量按式(2)计算:
Xα=ρ
α×V×100
(2)
式中:
Xα ---试样中α-胡萝卜素的含量,单位为微克每百克(μg/100g);
ρα ---从标准曲线得到的待测液中α-胡萝卜素浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
V ---试样液定容体积,单位为毫升(mL);
100---将结果表示为微克每百克(μg/100g)的系数;
试样中β-胡萝卜素含量按式(3)计算:
Xβ=
(Aal-E+A9Z+A13Z×1.2+A15Z×1.4+AxZ)×V×100
RF×m
(3)
式中:
Xβ ---试样中β-胡萝卜素的含量,单位为微克每百克(μg/100g);
Aal-E ---试样待测液中全反式β-胡萝卜素峰面积,单位为峰面积(AU);
A9Z ---试样待测液中9-顺式-β-胡萝卜素的峰面积,单位为峰面积(AU);
1.2 ---13-顺式-β-胡萝卜素的相对校正因子;
A15Z ---试样待测液中15-顺式-β-胡萝卜素的峰面积,单位为峰面积(AU);
1.4 ---15-顺式-β-胡萝卜素的相对校正因子;
AxZ ---试样待测液中其他顺式β-胡萝卜素的峰面积,单位为峰面积(AU);
V ---试样液定容体积,单位为毫升(mL);
100 ---将结果表示为微克每百克(μg/100g)的系数;
RF ---全反式β-胡萝卜素响应因子,单位为峰面积毫升每微克(AU·mL/μg);
m ---试样质量,单位为克(g)。
注1:由于β-胡萝卜素各异构体百分吸光系数不同(见附录D),所以在β-胡萝卜素计算过程中,需采用相对校正因
注2:如果试样中其他顺式β-胡萝卜素含量较低,可不进行计算。
试样中总胡萝卜素含量按式(4)计算:
X总 =Xα+Xβ (4)
式中:
X总---试样中总胡萝卜素的含量,单位为微克每百克(μg/100g);
Xα ---试样中α-胡萝卜素的含量,单位为微克每百克(μg/100g);
Xβ ---试样中β-胡萝卜素的含量,单位为微克每百克(μg/100g)。
注:必要时,α-胡萝卜素,β-胡萝卜素可转化为微克视黄醇当量(μgRE)进行表示。
计算结果保留三位有效数字。
试样中β-胡萝卜素含量按式(5)计算:
Xβ=
ρβ×V×100
(5)
式中:
Xβ ---试样中β-胡萝卜素的含量,单位为微克每百克(μg/100g);
ρβ ---从标准曲线得到的待测液中β-胡萝卜素浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
V ---试样液定容体积,单位为毫升(mL);
100---将结果表示为微克每百克(μg/100g)的系数;
注:结果中包含全反式β-胡萝卜素、9-顺式-β-胡萝卜素、13-顺式-β-胡萝卜素、15-顺式-β-胡萝卜素、其他顺式异构
体;不排除可能有部分α-胡萝卜素。
计算结果保留三位有效数字。
7 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
8 其他
试样称样量为5g时,α-胡萝卜素、β-胡萝卜素检出限均为0.5μg/100g,定量限均为1.5μg/100g。
附 录 A
标准溶液浓度标定方法
α-胡萝卜素标准储备液(浓度约为500μg/mL)10μL,注入含3.0mL正己烷的比色皿中,混匀。比
色杯厚度为1cm,以正己烷为空白,入射光波长为444nm,测定其吸光度值,平行测定3次,取均值。
溶液浓度按式(A.1)计算:
X=
E ×
3.01
0.01
(A.1)
式中:
A ---α-胡萝卜素标准储备液的紫外吸光值;
E ---α-胡萝卜素在正己烷中的比吸光系数为0.2725;
3.01
0.01
---测定过程中稀释倍数的换算系数。
A.2 β-胡萝卜素标准储备液的标定
取β-胡萝卜素标准储备液(浓度约为500μg/mL)10μL,注入含3.0mL正己烷的比色皿中,混匀。
比色杯厚度为1cm,以正己烷为空白,入射光波长为450nm,测定其吸光度值,平行测定3次,取均值。
溶液浓度按式(A.2)计算:
E ×
3.01
0.01
(A.2)
式中:
X ---β-胡萝卜素标准储备液的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
A ---β-胡萝卜素标准储备液的紫外吸光值;
E ---β-胡萝卜素在正己烷中的比吸光系数为0.2620;
3.01
---测定过程中稀释倍数的换算系数。
附 录 B
β-胡萝卜素异构体保留时间的确认及全反式β-胡萝卜素色谱纯度的计算
注:采用色谱条件一进行β-胡萝卜素的测定,需要确定β-胡萝卜素异构体保留时间,并对β-胡萝卜素标准溶液色谱
纯度进行校正。
B.1 试剂
碘溶液(I2):0.5mol/L。
B.2 试剂配制
B.2.1 碘乙醇溶液(0.05mol/L):吸取5mL碘溶液,用乙醇稀释至50mL,混匀。
匀后于日光下或距离40W日光灯30cm处照射15min,用二氯甲烷稀释至50mL。摇匀后过0.45μm
滤膜,备HPLC色谱分析用。
B.3 β-胡萝卜素异构体保留时间的确认
分别取β-胡萝卜素标准中间液(100μg/mL)和异构化β-胡萝卜素溶液,按照色谱条件一注入
HPLC仪进行色谱分析。根据β-胡萝卜素标准中间液的色谱图确认全反式β-胡萝卜素的保留时间;对
比β-胡萝卜素标准中间液和异构化β-胡萝卜素溶液色谱图中各峰面积变化,以及与全反式β-胡萝卜素
的位置关系确认顺式β-胡萝卜素异构体的保留时间:全反式β-胡萝卜素前较大的色谱峰为13-顺式-β-
胡萝卜素,紧邻全反式β-胡萝卜素后较大的色谱峰为9-顺式-β-胡萝卜素,13-顺式-β-胡萝卜素前是15-
顺式-β-胡萝卜素,另外可能还有其他较小的顺式结构色谱峰,色谱图见图C.1。
取β-胡萝卜素标准工作液(3μg/mL),按照色谱条件一进行 HPLC分析,重复进样6次。计算全
反式β-胡萝卜素色谱峰的峰面积、全反式与上述各顺式结构的峰面积总和,全反式β-胡萝卜素色谱纯
度按式(B.1)计算。
CP=
Aal-E
Asum
×100% (B.1)
式中:
CP ---全反式β-胡萝卜素色谱纯度,%;
Asum ---全反式β-胡萝卜素及各顺式结构峰面积总和平均值,单位为峰面积(AU)。
附 录 C
胡萝卜素液相色谱图
C.1 α-胡萝卜素和β-胡萝卜素混合标准色谱图(C30柱)
采用色谱条件一获得的α-胡萝卜素和β-胡萝卜素色谱图见图C.1。
说明:
Ⅰ---15-顺式-β-胡萝卜素;
Ⅱ---13-顺式-β-胡萝卜素;
Ⅲ---全反式α-胡萝卜素;
Ⅴ---9-顺式-β-胡萝卜素
图C.1 α-胡萝卜素和β-胡萝卜素混合标准色谱图
C.2 β-胡萝卜素液相色谱图(C18柱)
采用色谱条件二获得的β-胡萝卜素液相色谱图见图C.2。
图C.2 β-胡萝卜素标准品液相色谱图
附 录 D
胡萝卜素百分吸光系数
以正己烷为溶剂,α-胡萝卜素及β-胡萝卜素异构体的百分吸光系数见表D.1。
表D.1 胡萝卜素百分吸光系数
α-胡萝卜素 全反式 446 2725
β-胡萝卜素
全反式 450 2620
9-顺式 445 2550
13-顺式 443 2090
15-顺式 447 1820

GB 5009.83-2016
GB
NATIONAL STANDARD OF THE
PEOPLE’S REPUBLIC OF CHINA
National Food Safety Standard -
Determination of Carotene in Foods
ISSUED ON. DECEMBER 23, 2016
IMPLEMENTED ON. JUNE 23, 2017
Issued by. National Health and Family Planning Commission of the PRC;
China Food and Drug Administration.
Table of Contents
Foreword ... 3
1 Scope ... 4
2 Principles ... 4
3 Reagents and materials ... 4
4 Instruments and equipment ... 6
5 Analytical procedures ... 6
6 Analysis results expression ... 11
7 Precision ... 13
8 Others ... 13
Appendix A Calibration method for concentration of standard solution ... 15
Appendix B Confirmation of retention time of β-carotene isomers and
calculation of chromatographic purity of all-E-β-carotene ... 17
Appendix C Liquid chromatogram of carotene ... 19
Appendix D Percentile absorption coefficients of carotene ... 21
Foreword
This Standard replaces GB 5413.35-2010 “National Food Safety Standard -
Determination of β-carotene in foods for infants and young children, milk and
milk products”, GB/T 5009.83-2003 “Determination of carotene in foods”, and
NY/T 82.15-1988 “Method for determination of fruit juice - Determination of β-
carotene”.
As compared with GB 5413.35-2010, the main changes of this Standard are as
follows.
- The standard’s name is changed to “National Food Safety Standard -
Determination of Carotene in Foods”;
- ADD pretreatment methods for common foods;
- ADD the chromatographic conditions where α-carotene and β-carotene
need to be differentiated;
- MODIFY the results expression of carotene.
National Food Safety Standard -
Determination of Carotene in Foods
1 Scope
This Standard specifies the method for determination of carotene in foods.
This Standard’s chromatographic condition I is applicable to the determination
of α-carotene, β-carotene, and total carotene in foods. The chromatographic
condition II is applicable to the determination of β-carotene in foods.
2 Principles
The sample is saponified to release the carotene to a free state. After using
petroleum ether to extract dichloromethane and dilute, ADOPT reversed phase
chromatography to separate and external standard method to quantify.
3 Reagents and materials
Unless otherwise stated, the reagents used in this method are analytically pure.
The water is the Grade I water specified in GB/T 6682.
3.1 Reagents
3.1.1 α-amylase. Enzyme activity≥1.5 U/mg.
3.1.2 Papain. Enzyme activity≥5 U/mg.
3.1.3 Potassium hydroxide (KOH).
3.1.4 Anhydrous sodium sulfate (Na2SO4).
3.1.5 Ascorbic acid (C6H8O6).
3.1.6 Petroleum ether. The boiling range is 30 °C~60 °C.
3.1.7 Methanol (CH4O). chromatographically pure.
3.1.8 Acetonitrile (C2H3N). chromatographically pure.
3.1.9 Chloroform (CHCl3). chromatographically pure.
3.1.10 Methyl tert-butyl ether [CH3OC(CH3)3]. chromatographically pure.
3.1.11 Dichloromethane (CH2Cl2). chromatographically pure.
3.1.12 Anhydrous ethanol (C2H6O). guaranteed reagent.
3.1.13 N-hexane (C6H14). chromatographically pure.
3.1.14 2,6-di-tert-butyl-4-methylphenol (C15H24O, BHT).
3.2 Preparation of reagent
Potassium hydroxide solution. WEIGH 500 g of solid potassium hydroxide; ADD
3.3 Standards
3.3.1 α-carotene (C40H56, CAS number. 7488-99-5). Purity≥95%. Or a
reference material which has been certified by the state and awarded a
reference material certificate.
3.3.2 β-carotene (C40H56, CAS number. 7235-40-7). Purity≥95%. Or a reference
material which has been certified by the state and awarded a reference material
certificate.
3.4 Preparation of standard solutions
3.4.1 Standard stock solution of α-carotene (500 μg/mL). Accurately WEIGH 50
dichloromethane to dissolve; TRANSFER to a 100 mL brown volumetric flask
and DILUTE to volume. PROTECT it from light at below -20 °C. The service life
shall not exceed 3 months. The standard stock solution, before use, needs to
be calibrated. For specific operations, SEE Appendix A.
3.4.2 Standard intermediate solution of α-carotene (100 μg/mL). Accurately
PIPETTE 10.0 mL of standard stock solution of α-carotene into a 50 mL brown
volumetric flask; and USE dichloromethane to dilute to volume.
3.4.3 Standard stock solution of β-carotene (500 μg/mL). Accurately WEIGH 50
mg (accurate to 0.1 mg) of β-carotene standard; ADD 0.25 g of BHT; USE
and DILUTE to volume. PROTECT it from light at below -20 °C. The service life
shall not exceed 3 months. The standard stock solution, before use, needs to
be calibrated. For specific operations, SEE Appendix A.
Note. The β-carotene standard is mainly all-E-β-carotene. During storage, affected by
temperature, oxidation, and other factors, some all-E-β-carotene isomerizes to cis-
Liquid sample. WEIGH accurately 5 g~10 g (accurate to 0.001 g); PLACE in a
250 mL conical flask; and ADD 1 g of ascorbic acid.
5.2.2.2 Saponification
TAKE the pretreated sample; ADD 75 mL of anhydrous ethanol, SHAKE well;
PLACE in a constant temperature oscillating water bath which has been
preheated to 53 °C±2 °C to saponify for 30 min. REMOVE, LET stand, and
COOL to room temperature.
Note. If saponification is not complete, the saponification time may be appropriately
extended to 1 h.
5.3 Sample extraction
TRANSFER the saponification solution to a 500 mL separatory funnel; ADD 100
mL of petroleum ether, gently SHAKE, EXHAUST, and CAP the stopper. After
oscillating at room temperature for 10 min, LET it stand for stratification;
second extraction according to the above method. COMBINE the organic
phases; and USE water to wash to near-neutral. DISCARD the aqueous phase;
and the organic phase is dehydrated by filtration over anhydrous sodium sulfate.
The filtrate is collected in a 500 mL evaporating flask and concentrated under
reduced pressure at 40 °C±2 °C on a rotary evaporator until nearly dry. USE
nitrogen to blow-dry; USE a pipette to accurately add 5.0 mL of
dichloromethane; CAP the stopper to fully dissolve the extract. After filtering it
through a 0.45 μm membrane and discarding approximately 1 mL of the initial
filtrate, COLLECT in a sample injection bottle for use.
solution to be determined, so that the concentration of α-carotene and/or β-carotene
in the sample solution to be determined is in the range of 0.5 μg/mL~10 μg/mL.
5.4 Chromatographic determination
5.4.1 Chromatographic condition I (applicable to the determination of α-
carotene, β-carotene, and total carotene in foods)
5.4.1.1 Reference chromatographic conditions
Reference chromatographic conditions are listed below.
a) Chromatographic column. C30 column; the column length is 150 mm; the
inner diameter is 4.6 mm; the particle size is 5 μm; or equivalent column;
micrograms per milliliter (μg/mL);
CP - Chromatographic purity of all-E-β-carotene, %.
5.4.1.3 Sample determination
Under the same chromatographic conditions, INJECT the solution to be
determined into liquid chromatograph; qualitative based on the retention time;
based on the peak area, USE the external standard method to quantify. The
concentration of α-carotene in the solution to be determined shall be calculated
according to the standard curve regression equation. β-carotene shall be
calculated based on the all-E-β-carotene response factor.
carotene in foods)
5.4.2.1 Reference chromatographic conditions
Reference chromatographic conditions are listed below.
a) Chromatographic column. C18 column; the column length is 250 mm; the
inner diameter is 4.6 mm; the particle size is 5 μm; or equivalent column;
b) Mobile phase. chloroform. acetonitrile. methanol=3.12.85, containing 0.4
g/L of ascorbic acid, filtered through a 0.45 μm membrane for use;
c) Flow velocity. 2.0 mL/min;
d) Detection wavelength. 450 nm;
f) Injection volume. 20 μL.
5.4.2.2 Making of standard curve
INJECT the standard working solution of β-carotene into HPLC (for
chromatogram, SEE Figure C.2); qualitative based on the retention time;
DETERMINE the peak area. TAKE the concentration of standard series working
solution as the abscissa, the peak area as the ordinate, to plot standard curve;
and CALCULATE regression equation.
5.4.2.3 Sample determination
Under the same chromatographic conditions, INJECT the solutions to be
in peak area (AU);
A9Z - The peak area of 9-cis-β-carotene in the sample solution to be determined,
in peak area (AU);
A13Z - The peak area of 13-cis-β-carotene in the sample solution to be
determined, in peak area (AU);
1.2 - Relative correction factor of 13-cis-β-carotene;
A15Z - The peak area of 15-cis-β-carotene in the sample solution to be
determined, in peak area (AU);
1.4 - Relative correction factor of 15-cis-β-carotene;
determined, in peak area (AU);
V - Constant volume of sample solution, in milliliters (mL);
100 - The coefficient which expresses the result in micrograms per hundred
grams (μg/100 g);
RF - All-E-β-carotene response factor, in peak area milliliters per microgram
(AU · mL/μg);
m - Sample mass, in grams (g).
Note 1. Due to the different percentile absorption coefficients of the isomers of β-carotene
(SEE Appendix D), in the calculation for β-carotene, a relative correction factor
Note 2. If the content of other cis-β-carotene in the sample is low, the calculation may not
be performed.
The total carotene content in the sample shall be calculated according to the
equation (4).
Where.
Xtotal - Total carotene content in the sample, in micrograms per hundred grams
(μg/100 g);
Xα - The content of α-carotene in the sample, in micrograms per hundred grams
(μg/100 g);
Appendix B
Confirmation of retention time of β-carotene isomers and calculation of
chromatographic purity of all-E-β-carotene
Note. When chromatographic condition I is used for the determination of β-carotene, the
retention time of β-carotene isomers needs to be determined, and the
chromatographic purity of β-carotene standard solution shall be corrected.
B.1 Reagent
Iodine solution (I2). 0.5 mol/L.
B.2 Preparation of reagents
   
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