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GB 5009.89-2016

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GB 5009.89-2016 英文版 395 购买 现货,9秒内自动发货PDF,有增值税发票。 食品安全国家标准 食品中烟酸和烟酰胺的测定 有效

   
标准详细信息 GB 5009.89-2016; GB5009.89-2016
中文名称: 食品安全国家标准 食品中烟酸和烟酰胺的测定
英文名称: Determination of niacin in foods
行业: 国家标准
发布日期: 2016-12-23
实施日期: 2017-06-23
旧标准 (被替代): GB 5413.15-2010; GB/T 5009.89-2003; GB/T 9695.25-2008
标准依据: National Health and Family Planning Commission Notice No.17 of 2016

GB 5009.89-2016
National Food Safety Standard -- Determination of Niacin and Nicotinamide in Foods
中华人民共和国国家标准
食品安全国家标准
食品中烟酸和烟酰胺的测定
2016-12-23发布
2017-06-23实施
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会
国 家 食 品 药 品 监 督 管 理 总 局 发 布
前言
本标准代替GB/T5009.89-2003《食品中烟酸的测定》、GB5413.15-2010《食品安全国家标准
婴幼儿食品和乳品种烟酸和烟酰胺的测定》和GB/T 9695.25-2008《肉与肉制品 维生素PP含量测
定》。
本标准与GB 5413.15-2010相比,主要变化如下:
---标准名称修改为“食品安全国家标准食品中烟酸和烟酰胺的测定”;
---调整了试剂顺序和格式;
---修改并细化了适用于不同食品种类的前处理方法(第一法);
---增加了标准溶液浓度校正方法(第二法);
---重新评估了检出限,增加了定量限。
食品安全国家标准
食品中烟酸和烟酰胺的测定
1 范围
本标准规定了食品中烟酸和烟酰胺的测定方法。
本标准第一法为微生物法,适用于各类食品包括以天然食品为基质的强化食品中烟酸和烟酰胺总
量的测定;第二法为高效液相色谱法,适用于强化食品中烟酸和烟酰胺的测定。
第一法 微生物法
2 原理
烟酸(烟酰胺)是植物乳杆菌Lactobacillμsplantarμm(ATCC8014)生长所必需的营养素,在一定
控制条件下,利用植物乳杆菌对烟酸和烟酰胺的特异性,在含有烟酸和烟酰胺的样品中生长形成的光密
度来测定烟酸和烟酰胺的含量。
3 试剂和材料
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的二级水。培养基可购买符合
测试要求的商品化培养基。
3.1 菌种
植物乳杆菌Lactobacillμsplantarμm(ATCC8014),或其他有效标准菌株。
3.2 试剂
3.2.1 盐酸(HCl)。
3.2.2 氢氧化钠(NaOH)。
3.2.3 氯化钠(NaCl)。
3.2.4 浓硫酸(H2SO4)。
3.2.5 乙醇(C2H5OH)。
3.3 试剂配制
3.3.1 盐酸溶液(1mol/L):吸取83mL盐酸,于1000mL烧杯中,加917mL水,混匀。
3.3.2 盐酸溶液(0.1mol/L):吸取盐酸溶液(3.3.1)10mL,加水溶解至100mL。
3.3.3 氢氧化钠溶液(1mol/L):称取40g氢氧化钠于1000mL烧杯中,加水溶解并稀释至
1000mL,混匀。
3.3.4 氢氧化钠溶液(0.1mol/L):吸取氢氧化钠溶液(3.3.3)10mL,加水溶解至100mL。
3.3.5 生理盐水(0.9%):称取9g氯化钠,溶解于1000mL水中,分装10mL于试管中,121℃灭菌
15min,备用。
3.3.6 乙醇溶液(25%):量取200mL无水乙醇与800mL水混匀。
3.3.7 硫酸溶液(1mol/L):于2000mL烧杯中先注入700mL水,吸取56mL硫酸沿烧杯壁缓慢倒
入水中,用水稀释到1000mL。
3.4 培养基
3.4.1 乳酸杆菌琼脂培养基:可按A.1配制。
3.4.2 乳酸杆菌肉汤培养基:可按A.2配制。
3.4.3 烟酸测定用培养基:可按A.3配制。
注:一些商品化合成培养基效果良好,商品化合成培养基按标签说明进行配制。
3.5 标准品
烟酸(C6H5NO2):纯度≥99.5%,或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。
3.6 标准溶液配制
3.6.1 烟酸标准储备液(0.1mg/mL):精确称取50.0mg烟酸标准品,用乙醇溶液溶解并移至500mL
容量瓶中,定容,混匀于2℃~4℃冷藏。此溶液每毫升相当于100μg烟酸。
3.6.2 烟酸标准中间液(1μg/mL):准确吸取1.0mL烟酸标准储备液(3.6.1)置于100mL棕色容量瓶
中,用乙醇溶液稀释并定容至刻度,混匀于2℃~4℃冷藏。此溶液每毫升相当于1μg烟酸。
3.6.3 烟酸标准工作液(100ng/mL):准确吸取5.00mL烟酸标准中间液(3.6.2)置于50mL容量瓶
中,用水稀释定容至刻度,混匀于2℃~4℃冷藏。此溶液每毫升相当于100ng烟酸。
4 仪器和设备
4.1 天平:感量分别为0.01g和0.1mg。
4.2 均质设备:用于试样的均质化。
4.3 恒温培养箱:36℃±1℃。
4.4 涡旋振荡器。
4.5 压力蒸汽消毒器:121℃(0.10MPa~0.12MPa)。
4.6 离心机:转速≥2000r/min。
4.7 pH计:精度±0.01。
4.8 分光光度计。
4.9 超净工作台。
4.10 超声波振荡器。
注:玻璃仪器使用前,用活性剂(月桂磺酸钠或家用洗涤剂加入到洗涤用水中即可)对硬玻璃测定管及其他必要的
玻璃器皿进行清洗,清洗之后烘干,于170℃干热3h后使用。
5 分析步骤
将菌种植物乳杆菌Lactobacillμsplantarμm(ATCC8014)转接至乳酸杆菌琼脂培养基中,在36℃
±1℃恒温培养箱中培养20h~24h,取出后放入2℃~4℃冰箱中保存。每月至少传种一次,作为储
备菌株保存。
实验前将储备菌株接种至乳酸杆菌琼脂培养基中,在36℃±1℃恒温培养箱中培养20h~24h以
活化菌株,用于接种液的制备。保存数周以上的储备菌种,不能立即用作接种液制备,实验前宜连续传
种2代~3代以保证菌株活力。
5.2 接种液的制备
试验前一天,从乳酸杆菌琼脂培养基移取部分菌种于灭菌的10mL乳酸杆菌肉汤培养基中,于
36℃±1℃恒温培养箱中培养6h~18h。在无菌条件下离心该培养液15min,倾去上清液。加入
复离心和清洗步骤三次。以第三次细胞分散液中吸取1mL加入10mL已灭菌的生理盐水,使其充分
混合均匀制成混悬液,备用。用721分光光度计,在550nm波长下,以0.9%生理盐水为参比,读取该
菌悬液的透光值,用0.9%生理盐水或第三次细胞分散液调整透光值,使其范围在60%~80%之间。立
即使用。
5.3 试样制备
谷薯类、豆类、坚果(去壳)等试样需粉碎、研磨、过筛(筛板孔径0.3mm~0.5mm);乳粉、米粉等试
样混匀;肉、蛋、鱼、动物内脏等用打碎机制成食糜;果蔬、半固体食品等试样需匀浆混匀;液体试样用前
振摇混合。如不能马上检测,于4℃冰箱保存。
5.4 试样提取
脏、生肉、干制试样0.2g~1g(精确至0.01g),液态试样5g;乳粉、米粉等准确称取适量试样2g(精确
至0.01g);一般营养素补充剂、复合营养强化剂0.1g~0.5g;食品0.2g~1g;液体饮料或流质、半流质
试样5g~10g于100mL锥形瓶中,加入被检验物质干重10倍的硫酸溶液。在121℃下,水解30min
后冷却至室温。用0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.0~6.5,再用0.1mol/L盐酸调pH至4.5±0.1,
用水定容至100mL,用无灰滤纸过滤,滤液备用。
5.5 稀释
根据试样中烟酸含量用水对试样提取液进行适当稀释(f),使稀释后试样提取液中烟酸含量在
50.0ng~500.0ng范围内。
5.6 测定系列管制备
取试管分别加入烟酸标准工作液0.00mL、0.5mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、
4.0mL和5.00mL,补水至5.0mL,相当于标准系列管中烟酸含量为0.0ng、50ng、100ng、150ng、
200ng、250ng、300ng、400ng、500ng。加5.0mL烟酸测定用培养基,见表1。混匀。每个标准点应制
备3管。
表1 标准曲线管的制作
试管号(No.) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
蒸馏水/mL 5 5 4.5 4 3.5 3 2.5 2 1 0
标准溶液*/mL 0 0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 4 5
培养基/mL 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5
No.3~10中添加标准品溶液的浓度依次增高。3个重复。
5.6.2 试样系列管
取4支试管,分别加入1.0mL、2.0mL、3.0mL、4.0mL试样提取液,补水至5.0mL,加入5.0mL
烟酸测定用培养液,见表2。混匀,每个浓度做3个重复。
表2 试样管的制作
试管号(No.) 1 2 3 4
蒸馏水/mL 4 3 2 1
样品/mL 1 2 3 4
培养基/mL 5 5 5 5
将所有的标准系列管和试样系列管测定管塞好棉塞,于121℃(0.10MPa~0.12MPa)高压灭菌
5min。灭菌完成后,迅速冷却,备用。
5.7 培养
5.7.1 接种:在无菌操作条件下,将接种液转入无菌滴管,向每支测定管接种一滴。
5.7.2 培养:将加完菌液的试管置于36℃±1℃恒温培养箱中培养16h~24h,直至获得最大浊度,即
再培养2h浊度无明显变化。另准备一支标准0管(含0.0ng烟酸)不接种作为0对照管。
5.8 测定
用厚度为1cm比色杯,在波长550nm条件下读取光密度值,将培养好的测定管用涡旋混匀器混
匀。以未接种0对照管调节透光率为100%,然后依次测定标准系列管、试样系列管的透光率。取出最
两次光密度的绝对差结果≤2%,则取出全部检验管测定标准溶液和试样的光密度。
5.9 标准曲线的制作
以标准系列管烟酸含量为横坐标,光密度值为纵坐标,绘制标准曲线,也可对各个标准点做拟合曲
线。各个标准点3管之间的光密度值的相对标准偏差应小于10%,如果某一标准点3支试样管中有
2支烟酸含量落在50ng~500ng范围内,且该两管之间折合为每毫升试样提取液中烟酸含量的偏差小
于10%,则该结果可用,如果3支试样管中烟酸含量的相对标准偏差大于10%,则该点舍去,不参与标
准曲线的绘制。
6 分析结果的表述
试样结果计算:从标准曲线查得试样系列管中烟酸的相应含量(ρ),按式(1)进行结果计算。
X=ρ
×V1×f
m ×
100
1000
(1)
式中:
X ---试样中烟酸含量,单位为毫克每百克(mg/100g);
ρ ---试样系列管折合为试样提取液中烟酸浓度平均值,单位为纳克每毫升(ng/mL);
f --- 试样提取液稀释倍数;
m ---试样质量,单位为克(g);
100
1000
---折算成每百克试样中烟酸毫克数的换算系数。
结果保留两位有效数字。
7 精密度
普通食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%;强化
食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。
按样品种类将待测试样稀释到线性范围内再对样品进行测试。
本标准试管法线性范围50ng/mL~500ng/mL;天然类等含量较低的食品试样称样量为5g时,
检出限为0.05mg/100g,定量限为0.1mg/100g;强化食品等含量较高的食品试样称样量为1g时,检
出限为0.25mg/100g,定量限为0.5mg/100g。
第二法 高效液相色谱法
9 原理
高蛋白样品经沉淀蛋白质,高淀粉样品经淀粉酶酶解,在弱酸性环境下超声波振荡提取,以C18色
谱柱分离,在紫外检测器检测261nm波长处检测,根据色谱峰的保留时间定性,外标法定量,计算试样
中烟酸和烟酰胺含量。
除非另有说明,本方法所用试剂均为分析纯,水为GB/T 6682规定的一级水。
10.1 试剂
10.1.1 盐酸(HCl):优级纯。
10.1.2 氢氧化钠(NaOH):优级纯。
10.1.3 高氯酸(HClO4):体积分数为60%,优级纯。
10.1.4 甲醇(CH3OH):色谱纯。
10.1.5 异丙醇(C3H8O):色谱纯。
10.1.6 庚烷磺酸钠(C7H15NaO3S):色谱纯。
10.1.7 淀粉酶:酶活力≥1.5μ/mg。
10.2.1 盐酸(5.0mol/L):用量筒量取415mL盐酸,于1000mL烧杯中,加585mL水,混匀。
10.2.2 盐酸(0.1mol/L):用移液管吸取8.3mL盐酸,于1000mL烧杯中,加991.7mL水,混匀。
10.2.3 氢氧化钠(5.0mol/L):称取200g氢氧化钠(3.2.2)于烧杯中加水溶解并转移至1000mL容量
瓶中,加水定容,混匀。
10.2.4 氢氧化钠(0.1mol/L):称取4.0g氢氧化钠(3.2.2)于烧杯中加水溶解并转移至1000mL容量
瓶中,加水定容,混匀。
10.2.5 流动相:甲醇70mL、异丙醇20mL、庚烷磺酸钠1g,用910mL水溶解并混匀后,用高氯酸调
pH至2.1±0.1,经0.45μm膜过滤。
10.3 烟酸和烟酰胺标准溶液
物质。
10.3.1 烟酸和烟酰胺标准储备液(1.000mg/mL):准确称取烟酸及烟酰胺标准品各0.05g(精确到
0.1mg),分别置于100mL容量瓶中,用0.1mol/L盐酸溶解,定容至刻度,混匀(4℃冰箱中可保存
1个月)。
注:标准储备液配制完以后,需要进行浓度校正,校正方法见附录B。
10.3.2 烟酸和烟酰胺标准混合中间液(100.0μg/mL):准确吸取烟酸和烟酰胺标准储备液(10.3.1)各
10.0mL于100mL容量瓶中,加水定容至刻度,混匀。临用前配制。
10.3.3 烟酸和烟酰胺标准混合工作液:分别准确吸取标准混合中间液(10.3.2)1.0mL、2.0mL、
5.0mL、10.0mL、20.0mL于100mL容量瓶中,加水定容至刻度,混匀,得到浓度分别为1.0μg/mL、
11 仪器和设备
11.1 天平:感量0.1mg。
11.2 恒箱培养箱:30℃~80℃。
11.3 超声波振荡器。
11.4 pH计:精度±0.01。
11.5 高效液相色谱仪:带紫外检测器。
11.6 一次性微孔滤头:带0.45μm微孔滤膜。
12 分析步骤
12.1 试样制备与处理
12.1.1 淀粉类和含淀粉的食品(即食谷物、面包、饼干、面条、小麦粉和杂粮粉等制品)
称取混合均匀固体试样约5.0g(精确到0.01g),加入约25mL45℃~50℃的水,称取混合均匀液
体试样约20.0g(精确到0.01g)于150mL锥形瓶中,加入约0.5g淀粉酶,摇匀后向锥形瓶中充氮,盖
上塞,置于50℃~60℃的培养箱内培养约30min,取出冷却至室温。
注:如果条件允许,建议酶解时采用55℃±5℃水浴振摇。
12.1.2 不含淀粉的食品(调制乳、调制乳粉、饮料类、固体饮料类、豆粉和豆浆粉等制品)
称取混合均匀固体试样约5.0g(精确到0.01g),加入约25mL45℃~50℃的水,称取混合均匀液
体试样约20.0g(精确到0.01g)于150mL锥形瓶中,置于超声波振荡器中振荡约10min以上充分溶
解,静置5min~10min,并冷却至室温。
待试样溶液降至室温后,用5.0mol/L盐酸溶液和0.1mol/L盐酸溶液调节试样溶液的pH 至
1.7±0.1,放置约2min后,再用5.0mol/L氢氧化钠溶液和0.1mol/L氢氧化钠溶液调节试样溶液的
pH至4.5±0.1,置于50℃水浴超声波振荡器中振荡10min以上充分提取,冷却至室温后转至100mL
容量瓶中,用水反复冲洗锥形瓶,洗液合并于100mL容量瓶中,用水定容至刻度后混匀,经滤纸过滤。
滤液再经0.45μm微孔滤膜加压过滤,用样品瓶收集,即为试样测定液。
注:必要时,试样测定液用水进行适当的稀释(f),使试样测定液中烟酸和烟酰胺浓度在1μg/mL~20μg/mL范
围内。
12.2 参考液相色谱条件
参考液相色谱条件列出如下:
b) 柱温:25℃±0.5℃;
c) 紫外检测器:检测波长为261nm;
d) 流动相:甲醇70mL、异丙醇20mL、庚烷磺酸钠1g,用910mL水溶解并混匀后,用高氯酸调
pH至2.1±0.1,经0.45μm膜过滤;
e) 流速:1.0mL/min;
f) 进样量:10μL或20μL。
12.3 测定
12.3.1 标准曲线测定
按照已经确立的色谱条件,将烟酸及烟酰胺混合标准系列测定液依次按上述推荐色谱条件进行测
液的浓度为横坐标,绘制标准曲线。
12.3.2 试样溶液的测定
将试样测定液按上述推荐色谱条件进样测定。记录各组分色谱峰面积或峰高,根据标准曲线计算
出试样测定液中烟酸及烟酰胺各组分的浓度ρ。
13 分析结果的表述
13.1 试样烟酸和烟酰胺含量计算
试样中烟酸或烟酰胺的含量,按式(2)计算:
X1或2=ρ×
V×100
式中:
X1或2---试样中烟酸或烟酰胺的含量,单位为微克每百克(μg/100g);
ρ ---试样待测液中烟酸或烟酰胺的浓度,单位为微克每毫升(μg/mL);
V ---试样溶液的体积,单位为毫升(mL);
m ---试样的质量,单位为克(g)。
注:液态试样中烟酸或烟酰胺含量也可以微克每百毫升(μg/100mL)为单位。
13.2 试样中维生素PP的总含量
试样中维生素PP的总含量X,按式(3)计算:
X=X1+X2×1.008 (3)
X ---试样中维生素PP的总含量,单位为微克每百克(μg/100g);
X1 ---试样中烟酸的含量,单位为微克每百克(μg/100g);
X2 ---试样中烟酰胺的含量,单位为微克每百克(μg/100g);
1.008---烟酰胺转化成烟酸的系数。
13.3 结果表述
结果保留到整数。
14 精密度
在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的10%。
15 其他
40μg/100g,定量限为120μg/100g。
附 录 A
培养基和试剂
A.1 乳酸杆菌琼脂培养基
A.1.1 成分
光解胨 15g
葡萄糖 10g
磷酸氢二钾 2g
聚山梨糖单油酸酯 1g
琼脂
蒸馏水
10g
1000mL
A.1.2 制法
先将除琼脂以外的其他成分溶解于蒸馏水中,调节pH6.8±0.2(20℃~25℃),再加入琼脂,加热
煮沸,使琼脂融化。混合均匀后分装试管,每管10mL。121℃高压灭菌15min,备用。
A.2 乳酸杆菌肉汤培养基
A.2.1 成分
葡萄糖 10g
磷酸氢二钾 2g
聚山梨糖单油酸酯 1g
番茄汁
蒸馏水
100mL
1000mL
A.2.2 制法
将上述成分溶解于水中,调节pH6.8±0.2(20℃~25℃),分装10mL于试管中,121℃高压灭菌
A.3 烟酸测定用培养基
A.3.1 成分
酪蛋白氨基酸 12g
葡萄糖 40g
乙酸钠 20g
L-胱氨酸 0.4g
DL-色氨酸 0.2g
盐酸腺嘌呤 20mg
盐酸鸟嘌呤 20mg
盐酸硫胺素 200μg
泛酸钙 200μg
盐酸吡哆醇 400μg
核黄素 400μg
p-氨基苯甲酸 100μg
生物素 0.8μg
磷酸氢二钾 1g
磷酸二氢钾 1g
硫酸镁 0.4g
硫酸亚铁 20mg
硫酸锰 20mg
蒸馏水 1000mL
注:自行配制烟酸测定培养基时,所有试剂不得含有烟酸。
A.3.2 制法
将上述成分溶解于水中,调pH至6.7±0.2(20℃~25℃),备用。
附 录 B
标准溶液浓度校正方法
烟酸或烟酰胺标准储备溶液配制后需要对浓度进行校正,具体操作如下:
用0.1mol/L盐酸定容至刻度混匀,按给定波长测定溶液的吸光值,用比吸光系数计算出该溶液中烟酸
或烟酰胺的浓度。测定条件见表B.1。
表B.1 烟酸和烟酰胺吸光值的测定条件
标准 比吸光系数E1%cm 波长λ/nm
烟酸 420 260
烟酰胺 410 260
浓度按式(B.1)计算:
c1=
E ×
(B.1)
式中:
c1---溶液中烟酸或烟酰胺的浓度,单位为克每毫升(g/mL);
A---溶液中烟酸或烟酰胺的平均紫外吸光值;
E---烟酸或烟酰胺1%比吸光系数。
附 录 C
烟酸和烟酰胺标准溶液的液相色谱图
烟酸和烟酰胺标准溶液的液相色谱图见图C.1。
图C.1 烟酸和烟酰胺标准溶液的液相色谱图
98􀏕 9005

GB 5009.89-2016
GB
NATIONAL STANDARD OF THE
PEOPLE’S REPUBLIC OF CHINA
National food safety standard
Determination of niacin and nicotinamide in foods
食品安全国家标准
食品中烟酸和烟酰胺的测定
ISSUED ON. DECEMBER 23, 2016
IMPLEMENTED ON. JUNE 23, 2017
Issued by. National Health and Family Planning Commission of the
People’s Republic of China;
China Food and Drug Administration.
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Table of Contents
Foreword ... 3
1 Scope ... 4
2 Principle ... 4
3 Reagents and materials ... 4
4 Instruments and equipment ... 6
5 Analysis procedure ... 6
6 Expression of analysis results ... 9
7 Precision ... 10
8 Others ... 10
9 Principle ... 10
10 Reagents and materials ... 11
11 Instruments and equipment ... 12
12 Analysis procedure ... 12
13 Expression of analysis results ... 14
14 Precision ... 15
15 Others ... 15
Annex A Medium and reagents ... 16
Annex B Standard solution concentration calibration method ... 19
Annex C Liquid chromatogram of niacin and nicotinamide standard solutions
... 20
Foreword
The Standard replaces GB/T 5009.89-2003 “Determination of niacin in foods”, GB
5413.15-2010 “National food safety standard - Determination of vitamin niacin and
niacinamide in foods for infants and young children, milk and milk products” and GB/T
9695.25-2008 “Meat and meat products - Determination of vitamin PP content”.
Compared with GB 5413.15-2010, the main changes of this Standard are as follows.
- The standard name is changed to “National food safety standard - Determination
of niacin and nicotinamide in foods”;
- ADJUST the reagent sequence and format;
- MODIFY and REFINE the pre-treatment methods applicable to different food types
(Method I);
- ADD the standard solution concentration calibration method (Method II);
- REASSESS the detection limit, ADD the limit of quantification.
National food safety standard –
Determination of niacin and nicotinamide in foods
1 Scope
This Standard specifies the determination method for niacin and nicotinamide in foods.
In this Standard, method I is microbiological method, which is applicable for the
determination of the total content of niacin and nicotinamide in all types of foods
including fortified foods using natural foods as the base. Method II is high performance
liquid chromatography, which is applicable for the determination of acid and
nicotinamide in fortified foods.
Method I Microbiological method
2 Principle
Niacin (nicotinamide) is a nutrient necessary for the growth of Lactobacillus plantarum
(ATCC 8014). Under certain control conditions, use the specificity of Lactobacillus
plantarum to niacin and nicotinamide that forms the optical density in the sample
containing niacin and nicotinamide, to determine the content of niacin and nicotinamide.
3 Reagents and materials
Unless otherwise stated, the reagents used in this method are analytical reagents, and
the water is Grade 2 water specified in GB/T 6682. The medium can be
commercialized medium that meets the test requirements.
Lactobacillus plantarum (ATCC 8014), or other valid standard strains.
3.2 Reagents
3.2.1 Hydrochloric acid (HCl).
3.2.2 Sodium hydroxide (NaOH).
3.2.3 Sodium chloride (NaCl).
stock strains.
The stock strain is inoculated into Lactobacillus agar medium before the test, and
cultured in the incubator at 36 °C ± 1 °C for 20 h ~ 24 h to activate the strain for the
preparation of inoculation solution. Stock strains that are stored more than a few weeks
continuously inoculated 2 generations to 3 generations before the test to ensure the
vitality of the strain.
5.2 Preparation of inoculation solution
One day before the test, MOVE part of the strain from the Lactobacillus agar medium
to 10 mL of sterilized Lactobacillus broth medium, and CULTURE in the incubator at
36 °C ± 1 °C for 6 h ~ 18 h. Under aseptic conditions, CENTRIFUGE the culture broth
for 15 min and DISCARD the supernatant. ADD 10 mL of sterilized physiological saline
to re-disperse the cells; MIX thoroughly on a vortex mixer; CENTRIFUGE for 15 min;
DISCARD the supernatant. REPEAT the centrifugation and cleaning steps three times.
physiological saline, so that it is mixed evenly into a suspension, for further use. The
light transmittance value of the suspension is read with a 721 spectrophotometer at a
wavelength of 550 nm and using 0.9 % saline as a reference. The light transmittance
value is adjusted with 0.9 % physiological saline or third-time cell dispersion solution
to be within 60 % to 80 %. USE immediately.
5.3 Preparation of samples
Potatoes, beans, nuts (shelled) samples shall be crushed, ground and sieved (the
aperture of sieve plate is 0.3 mm ~ 0.5 mm); milk powder and rice flour samples shall
be mixed well; meat, eggs, fish, animal viscera shall be made into chyme with crushing
homogeneously; liquid samples shall be shaken to mix well before use. If the sample
cannot be tested immediately, it shall be stored in the refrigerator at 4 °C.
5.4 Extraction of samples
Accurately weigh niacin samples. WEIGH 2 g ~ 5 g (accurate to 0.01 g) of general
dairy, fresh fruit and vegetable sample; WEIGH 0.2 g ~ 1 g (accurate to 0.01 g) of
cereals, beans, nuts, viscera, raw meat, dry sample, 5 g of liquid sample; accurately
WEIGH 2 g (accurate to 0.01 g) of milk powder, rice flour sample; WEIGH 0.1 g ~ 0.5
g of general nutrient supplement and complex nutrition enhancer; WEIGH 0.2 g ~ 1 g
of food; WEIGH 5 g ~ 10 g of liquid beverage or liquid, semi-liquid sample in a 100-mL
tested substance. After hydrolysis at 121 °C for 30 min, cool to room temperature. USE
0.1 mol/L sodium hydroxide solution to adjust the pH to 6.0 ~ 6.5, then USE 0.1 mol/L
hydrochloric acid to adjust the pH to 4.5 ± 0.1, DILUTE with water to 100 mL, FILTER
calculate the content of niacin and nicotinamide in the sample.
10 Reagents and materials
Unless otherwise stated, the reagents used in this method are analytical regents and
the water is Grade 1 water specified in GB/T 6682.
10.1 Reagents
10.1.1 Hydrochloric acid (HCl). guarantee reagent.
10.1.3 Perchloric acid (HClO4). with volume fraction of 60 %, guarantee reagent.
10.1.4 Methanol (CH3OH). chromatographically pure.
10.1.5 Isopropyl alcohol (C3H8O). chromatographically pure.
10.1.6 Sodium heptanesulfonate (C7H15NaO3S). chromatographically pure.
10.1.7 Amylase. with enzyme activity ≥ 1.5 μ/mg.
10.2 Preparation of reagents
10.2.1 Hydrochloric acid (5.0 mol/L). MEASURE 415 mL of hydrochloric acid with a
measuring cylinder in a 1000 mL flask; ADD 585 mL of water; MIX well.
10.2.2 Hydrochloric acid (0.1 mol/L). PIPETTE 8.3 mL of hydrochloric acid with a
10.2.3 Sodium hydroxide (5.0 mol/L). WEIGH 200 g of sodium hydroxide (3.2.2) in the
flask and ADD water to dissolve; TRANSFER to a 1000-mL volumetric flask; ADD
water to the constant volume; MIX well.
10.2.4 Sodium hydroxide (0.1 mol/L). WEIGH 4.0 g of sodium hydroxide (3.2.2) in the
flask and ADD water to dissolve; TRANSFER to a 1000-mL volumetric flask; ADD
water to the constant volume; MIX well.
10.2.5 Mobile phase. 70 mL of methanol, 20 mL of isopropanol and 1 g of sodium
heptanesulfonate, that are dissolved with 910 mL of water and mixed well, with the pH
adjusted to 2.1 ± 0.1 with perchloric acid, and filtered through 0.45 μm membrane.
Niacin (C6H5NO2) and nicotinamide (C6H6N2O). with purity > 99 %, or reference
materials certified by the state and awarded the reference material certificate.
ADD about 25 mL of water at 45 °C to...
   
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